Charakterisierung von Oligomerisierungsdomänen des Marburg-Virus Nukleoprotein und deren funktionelle Bedeutung

Das phosphorylierte Nukleokapsidprotein NP ist Hauptbestandteil des Marburg-Virus (MARV)-Nukleokapsidkomplexes (NC). Neben NP sind drei weitere virale Strukturproteine, VP35, VP30, L, und die genomische RNA in den NC eingebunden. NP, VP35 und L können die virale Transkription und Replikation in eine...

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Main Author: Di Carlo, Andrea
Contributors: Klenk, Hans-Dieter, Prof. Dr. (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2004
Hygiene u. Med. Mikrobiologie mit Medizinaluntersuchungsamt
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Das phosphorylierte Nukleokapsidprotein NP ist Hauptbestandteil des Marburg-Virus (MARV)-Nukleokapsidkomplexes (NC). Neben NP sind drei weitere virale Strukturproteine, VP35, VP30, L, und die genomische RNA in den NC eingebunden. NP, VP35 und L können die virale Transkription und Replikation in einem in vitro Transkriptions/ Replikationssystem vermitteln. NP interagiert mit sich selbst, mit VP35 und VP30. Die Interaktion des NP mit sich selbst (Homooligomerisierung) führt zur Ausbildung von helikalen Strukturen, die das Grundgerüst des NC bilden. In MARV-infizierten Zellen sowie bei rekombinanter Expression des NP lagern sich die NC zu charakteristischen Einschlusskörpern (EK) zusammen. In der vorliegenden Arbeit wurden Homo- und Heterooligomerisierungsdomänen auf dem NP charakterisiert und strukturelle sowie funktionelle Merkmale untersucht. Durch Deletionsmutanten des NP wurden drei wichtige Aminosäurebereiche bestimmt, die die Homooligomerisierung beeinflussen: AS 118-234 (N), AS 320-400 (CC) und AS 522-695 (C). Für CC konnte direkt gezeigt werden, dass dieser Bereich notwendig und ausreichend zur Vermittlung der Homooligomerisierung ist. CC zeigt alle Merkmale zweier Coiled-Coil-Motive (C1: AS 320-50, C2: AS 371-400; CC). Die durch CC-vermittelte Interaktion konnte durch den monoklonalen a-NP Antikörper 2B10 gehemmt werden. Das von diesem Antikörper erkannte Epitop wurde auf die AS 391-410 eingegrenzt. Deletionen von CC zeigten, dass ein intaktes Doppel-Coiled-Coil-Motiv für die NP-abhängige virale Transkription unerlässlich ist. Die Bereiche N und C können miteinander interagieren. Wahrscheinlich findet der Kontakt von N und C intramolekular statt und reguliert die Aktivität von CC. Die kürzeste NP-Mutante, die zur Bildung von Einschlusskörpern fähig ist, umfasst die ersten 270 AS. Wahrscheinlich sind diese AS ausreichend, helikale Nukleokapsidähnliche Strukturen auszubilden, die sich in Einschlusskörpern aneinanderlagern. VP35 bindet in den ersten 390 AS des NP. Die Bindung zwischen beiden Proteinen ist offenbar abhängig von der Kooperation verschiedener NP-Bereiche. Erforderlich, aber nicht ausreichend für die Interaktion zwischen VP35 und NP ist CC. Sowohl die Bindung des NP an sich selbst als auch die Bindung an VP35 sind von der Phosphorylierung eines charakteristischen Serinclusters (AS 450-455) abhängig. Die VP35-Interaktion nimmt mit zunehmender Phosphorylierung des Serinclusters ab. Die Homooligomerisierung ist bei dephosphoryliertem oder komplett phosphorylierten Serincluster gering. Sind einige Serinreste nicht phosphoryliert ist die Homooligomerisierung wildtypisch. Die Phosphorylierung des Serinclusters reguliert auch die Funktion des NP während der viralen Transkription. NP mit dephosphoryliertem oder komplett phosphoryliertem Serincluster vermittelt keine Transkription mehr. Für die Funktion des NP ist unerlässlich, dass einige Serinreste des Serinclusters nicht phosphoryliert sind.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2004.0710