Oktaedrische vakuoläre Proteinkristalle in Phycomyces blakesleeanus: Biochemische und fluoreszenzspektroskopische Charakterisierung

Die negativ gravitropen Sporangiophoren des Zygomyceten Phycomyces blakesleeanus enthalten in ihrem zentralen Vakuolensystem parakristalline Proteinkörper. Diese sogenannten oktaedrischen Kristalle sedimentieren und zeigen eine passive Verlagerung nach Reorientierung der Sporangiophore im Raum. Aufg...

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Main Author: Fries, Volker
Contributors: Galland, Paul (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2004
Biologie
Subjects:
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Description
Summary:Die negativ gravitropen Sporangiophoren des Zygomyceten Phycomyces blakesleeanus enthalten in ihrem zentralen Vakuolensystem parakristalline Proteinkörper. Diese sogenannten oktaedrischen Kristalle sedimentieren und zeigen eine passive Verlagerung nach Reorientierung der Sporangiophore im Raum. Aufgrund dessen wird ihre Funktion als Statolithen zur Graviperzeption diskutiert. Die Dichte der Kristalle variiert zwischen von 1,247 und 1,271 g cm-3. Isolierte Kristalle zeigen in der SDS-PAGE drei Proteine mit relativen Molekulargewichten von 16, 46,5 und 55 kDa. Diese Proteine finden sich nicht in Gravitropismus - Mutanten, welchen die Kristalle fehlen. Absorptionsspektren isolierter Kristalle deuteten auf die Anwesenheit von chromophoren Gruppen hin. Fluoreszensspektroskopische Untersuchungen bestätigten die Flavin- bzw. Pterin-Natur der mit den Kristallen assoziierten Chromophoren. Reduktion und Oxidation in vitro zeigten eine vom Redoxzustand abhängige Bindung der flavinartigen Chromophoren an die Kristalle. Bindungsstudien mit Riboflavin an isolierten Kristalle bestätigen dies und ergaben folgende Dissoziationskonstaten (KD, ox = 6x10-5M, KD, red = 2,8x10-5M). Ein einzelner Kristall (die durchschnittliche Höhe von WT-Kristallen betrug 3,91 µm und entsprach einem Volumen von 9,96 µm³) band etwa 106 flavinartige Pigmentmoleküle in reduziertem Zustand. Im Gegensatz dazu banden die pterinartigen Pigmente in oxidierter Form. Diese Redoxkombination der beiden Pigmente ermöglicht prinzipiell eine Elektronenübertragung zwischen den nicht-kovalent gebundenen Pigmenten (z. B. als Teilschritt einer Signaltransduktionskette). Fluoreszenzpolarisationsspektroskopie zeigte, dass die beiden Chromophore an die Proteinmatrix in nahezu paralleler Orientierung zueinander binden. Dies und die starke Überlappung der Fluoreszenzemissionsspektren der pterinartigen Chromophore und der Anregungspektren der flavinartigen Pigmente begünstigen eine strahlungslose Energieübertragung (Förstertransfer) vom pterin- auf das flavinartige Chromophor. Experimente zur gravitropen Beugung zeigten die untergeordnete Bedeutung der Statolithenfunktion der Kristalle im Gravitropismus im Vergleich zu den weiteren Gravisusceptionsmechanismen Zellwandbiegung und Auftrieb von Lipidglobuli. Stimulation der gravitropen Sporangiophorenbeugung durch tonisches Rotlicht zeigte eine Verrechnung von Photo- und Gravitropismus unter dem Einfluss der Kristall-Chromophore. Erste Befunde deuten auf eine Rolle von Ca2+ im Zusammenwirken mit den Kristallen für die Sporangiophorenbeugung hin. Dieser Hinweis wird gestützt durch Sequenzähnlichkeiten des 55 kDa-Kristall-Proteins mit in der Phototransduktion involvierten cGMP-gesteuerten Kanälen, einem calciumbindenden Protein sowie einer vakuolären ATPase. Sequenzübereinstimmungen mit schon bekannten Flavoproteinen konnten bisher noch nicht gefunden werden. Aufgrund ihrer Eigenschaften fungieren die oktaedrischen Kristalle von Phycomyces blakesleeanus über ihre Rolle als Statolithen hinaus wahrscheinlich als essentielle Elemente in der Verrechnung der Signaltransduktionswege von Photo- und Gravitropismus.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2004.0517