Microparticular and Nanoparticular DNA Delivery Systems as Adjuvants for DNA Immunization

In dieser Arbeit wurden mikropartikuläre und nanopartikuläre DNA-Trägersysteme mit dem Ziel einer adjuvanten Anwendung für DNA-Impfstoffe entwickelt. Deren Eignung wurde anhand physikalisch-chemischer Parameter charakterisiert. In Kapitel 3 haben wir das Doppelemulsionsverfahren und die Sprühtrocknung zur Herstellung von DNA-Mikropartikeln untersucht. Die DNA wurde in Lösung, als Polyethylenimin (PEI) 25 kDa Komplex, sowie in lyophilisierter Form in Anwesenheit von Lyoprotektoren verkapselt. Folgende Methoden zur Herstellung der DNA Mikropartikel wurden verwendet: (1) ein modifiziertes Doppelemulsions-verfahren (W/O/W), (2) ein Feststoff in Öl in Wasser Verfahren (S/O/W), (3) die Sprühtrocknung einer Wasser in Öl Dispersion (W/O) und (4) die Sprühtrocknung einer Feststoff in Öl Dispersion (S/O). Die Partikel aus dem Doppelemulsions-verfahren setzten DNA kontinuierlich frei, wohingegen die DNA aus sprühgetrockneten Mikropartikeln primär schlagartig freigesetzt wurde. Durch die Komplexierung mit PEI konnte die DNA-Freisetzung in allen Zubereitungen erheblich verlangsamt werden. In Kapitel 4 haben wir DNA an Oberflächen von Mikropartikeln adsorbiert. Durch die Integration unterschiedlicher Anteile kationischer Moleküle PEI oder CTAB in Polyestergerüste konnten wir Mikropartikel mit kationischen Oberflächeneigenschaften entwickeln. Partikel mit 10% PEI zeichneten sich durch besonders positive Eigenschaften, wie zum Beispiel einer geringen Partikelgröße, eines positiven x-Potentials von +47 mV und einer besonders guten DNA-Adsorptionseffizienz über den physiologischen pH-Bereich, aus. Konfokale Aufnahmen mit fluoreszenz-markierten PEI - Partikeln und DNA resultierten in diffuser Fluoreszenz im Zytoplasma von nicht-phagozytischen L929 Fibroblasten. Dies wurde auf das Herauslösen von PEI und der Bildung von Polyplexen zurückgeführt. Der Gen-Transfer der RG 502H+PEI 10% Partikel konnte des weiteren durch die Transfektion mit dem Reportergen Luciferase bestätigt werden. Daher setzten wir diese Partikel als Trägersystem für die DNA-Immunisierung von Mäusen gegen Listeria monocytogenes ein In Kapitel 5 wurde die Entwicklung eines neuen Polymersystems für die Verkapselung von DNA beschreiben. Diese Polymere wurden aus Poly-(vinyl-alkohol) und Diamin-Substituenten Diethylaminopropylamin (DEAPA), DMAPA oder DEAEA aufgebaut. Diese Polymer-Rückgrate wurden mit Seitenketten aus D,L-Laktid und Glykolid (50:50) aus 10 oder 20 Monomeren gepfropft.. Die amphiphilen Polymer-eigenschaften ermöglichten es, ein neues Verfahren zu Verkapselung von DNA zu ohne Verwendung von Scherkräften zu entwickeln. In Kapitel 6 wählten wir ein repräsentatives Polymer dieser neuen Polymerklasse, P(26)-10, um die Prozessparameter des Herstellungsverfahrens der DNA Nanopartikel zu charakterisieren. In Kapitel 7 wurden die neuartigen Polymersysteme durch die Formulierung von DNA Nanopartikeln in unterschiedlichen N/P Verhältnissen charakterisiert und in-vitro angewendet. Die Raster-Kraft-Mikroskopie konnte die gemessenen Partikelgrößen bestätigen. Durch Flow Cytometrie mit P(68)-10 DNA Nanopartikeln konnte gezeigt werden, dass die Partikelaufnahme in Zellen vom N/P Verhältnis abhängig ist. Der entsprechende Aufnahmemechanismus wurde mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie verfolgt. Die Aufnahme der Partikel in das endo/lysosomale Kompartiment und eine Freisetzung des kovalent gebundenen Polymerlabels in das Cytosol konnte beobachtet werden. Wir nehmen daher eine Freisetzung der Formulierung aus Endosomen durch einen osmotischen Effekt der PLGA Abbauprodukte in Kombination mit polykationischen Eigenschaften des Rückgrates an. Die ausgesprochen gute Transfektionseffizienz eines der Polymere, P(68)-10, wurde in unterschiedlichen N/P Verhältnissen und in vier Zelllinien untersucht und war bei gleichen N/P Verhältnissen vergleichbar mit PEI / DNA Komplexen.