Identifizierung des zentralen Polypeptids des generellen RNA-Polymerase III Transkriptionsfaktors TFIIIC1

Der Transkriptionsfaktor TFIIIC1 wird für die RNA-Synthese aller humanen Polymerase III-abhängigen Gene unabhängig vom jeweiligen Promotortyp essentiell benötigt. Innerhalb des humanen Pol III Systems ist TFIIIC1 der einzige Transkriptionsfaktor dessen Untereinheiten-Zusammensetzung bisher noch imme...

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Main Author: Gruber, Christin
Contributors: Prof. Dr. R. Lührmann (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2004
Subjects:
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Description
Summary:Der Transkriptionsfaktor TFIIIC1 wird für die RNA-Synthese aller humanen Polymerase III-abhängigen Gene unabhängig vom jeweiligen Promotortyp essentiell benötigt. Innerhalb des humanen Pol III Systems ist TFIIIC1 der einzige Transkriptionsfaktor dessen Untereinheiten-Zusammensetzung bisher noch immer ungeklärt blieb. Die Hauptaufgabe der vorliegenden Arbeit lag daher in der chromatographischen Reinigung von TFIIIC1-aktiven Fraktionen. Es sollte eine TFIIIC1-Präparation entstehen, die per MALDI TOF Analyse die Untersuchung der Polypeptid-Zusammensetzung von TFIIIC1 ermöglicht. Der eingesetzte Anionentauscher MiniQ ermöglichte neben der chromatographischen Reinigung auch eine Konzentrierung von TFIIIC1-aktiven Fraktionen, was für die anschließende präparative Gelfiltration essentiell war. Die Größenselektion über Gelfiltration als fünfter und zugleich letzter Schritt innerhalb der TFIIIC1 Reinigungsstrategie ermöglichte die MALDI TOF Analyse von sieben Polypeptiden, die als potentielle Untereinheiten von TFIIIC1 in Frage kamen. Die zur Auswertung dieser analysierten Polypeptide durchgeführten Western Blot Analysen sowie Immunodepletionen führten erstmalig zur Identifizierung des zentralen funktionellen Polypeptids von TFIIIC1. Dabei handelt es sich um das als "Transcription Factor-like Nuclear Regulator" bezeichnete Protein TFNR. Der N-Terminus dieses 250 kDa Proteins ist über 846 Aminosäuren mit dem 150-160 kDa Protein hBdp1 (hB’’, TFIIIB150) identisch, welches als basaler Pol III Transkriptionsfaktor und Bestandteil der humanen TFIIIB Aktivitäten beschrieben worden ist. Mit der Identifizierung des für die TFIIIC1 Transkriptionsaktivität verantwortlichen Polypeptids ist es zugleich gelungen für die 250 kDa-Variante von hBdp1 (TFNR) eine Funktion als essentiell benötigte Pol III Transkriptionsaktivität zu zeigen. Austauschexperimente zeigten, dass in vitro der N-Terminus von hBdp1 für eine effiziente Pol III Transkriptionsaktivität ausreichend ist.
DOI:10.17192/z2004.0420