Biochemical characterization of the Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) complex from Bacillus subtilis

Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) Proteine spielen eine zentrale Rolle in mehreren Aspekten von Chromosomen Dynamiken während des Zellzyklus in fast allen Zellen, von Bakterien bis zu Eukaryonten. Proteine der SMC Familie führen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von Prozessen aus, wie bei der Chromosomen-Kondensation und Segregation, Schwesterchromosomen Kohäsion und DNA Doppelstrandbruch Reparatur. SMC Proteine besitzen eine ungewöhnliche Struktur, bestehend aus N- und und C-terminalen Domänen, die ATPase Motive beinhalten, aus einer Scharnier „hinge“ Domäne und zwei zentralen coiled coil Domänen. Die terminalen Domänen kommen zusammen und bilden die Kopfdomäne aus, während die coiled coil Domänen ein coiled coil bilden. SMC Proteine bilden intermolekulare Dimere aus, durch spezifische Interaktion der hinge Domänen. Alle SMC Proteine fungieren in Komplexen mit weiteren Nicht-SMC Untereinheiten, und kürzlich wurden zwei neuartige prokaryontische Proteine identifiziert, ScpA and ScpB, die mit bakteriellem SMC Protein in vivo interagieren. In dieser Arbeit wurden biochemische Studien zur Eigenschaften und Funktion von SMC, ScpA und ScpB aus B. subtilis in vitro unternommen, um deren in vivo Funktion zu beleuchten. ScpB wurde in Lösung ausschließlich als Dimer vorgefunden, wohingegen ScpA in monomerer und in dimerer Form auftrat. Mit Hilfe von Gelfiltration, Gelshift Experimenten, Sucrose Gradienten Zentrifugation und Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR) konnte ich nachweisen, dass SMC, ScpA and ScpB einen ternären Komplex ausbilden, höchst wahrscheinlich bestehend aus einem SMC Dimer, zwei ScpA und vier ScpB Molekülen. ScpA und ScpB interagierten spezifisch mit der SMC Kopfdomäne, jedoch nur, wenn beide Proteine vorhanden waren, wobei die Interaktion von ScpB nur indirekt über ScpA mit der Kopfdomäne erfolgte. ScpA und ScpB bildeten ebenfalls mindestens zwei Komplexe in Abwesenheit von SMC, die sich anscheinend aus einem ScpA Monomer und einem ScpB Dimer, bzw. aus einem ScpA und zwei ScpB Dimeren zusammensetzten. Gelfiltrationsexperimente legten nahe, dass der SMC Komplex durch Bindung des 2ScpA/4ScpB Komplexes an ein SMC Dimer erfolgt, und nicht durch Interaktion einzelner ScpA und ScpB Moleküle. Sucrose Gradienten zeigten, dass alle drei Proteine als Komplex und als separate Moleküle vorliegen, was auf einen dynamische Interaktion in vivo schließen lässt. Des weiteren wurden die DNA Bindungseigenschaften des SMC Komplex und einzelner Domänen von SMC untersucht. SMC konnte Sequenz-unspezifisch an DNA binden, jedoch weder ScpA noch ScpB zeigten Affinität zu DNA, bzw. waren für die DNA Bindung des SMC Komplex notwendig. Die isolierte hinge oder Kopfdomäne von SMC waren ebenfalls unfähig, an DNA zu binden, was zeigt, dass das gesamte SMC Molekül zur effektiven Interaktion mit DNA notwendig ist. SPR Experimente zeigten, dass SMC als ringförmige Struktur an DNA bindet, vermutlich über Dimerisierung der Kopfdomänen, welches zum Ringschluß führt und zum Umschließen der DNA mit den langen coiled coil Armen. Kollaborative Atomic Force Microscopy Experimente konnten tatsächlich ringförmige SMC Strukturen nachweisen, sowie große, sonnenartige Strukturen in Lösung auflösen, welche eine Erklärung für die Beobachtung sein könnten, dass der SMC Komplex definierte, subzelluläre Strukturen auf dem bakteriellen Chromosom ausbildet und nicht über das gesamte Chromosom verteilt vorliegt. SMC Proteine haben eine schwache ATPase Aktivität und besitzen typische ABC Typ ATPase Motive. Mutagenese Studien erbrachten den Nachweis, dass ATP Bindung, nicht aber Hydrolyse, zur DNA Bindung von SMC notwendig ist. Keine der Mutationen war jedoch zur Komplexbildung mit ScpA und ScpB notwendig, obwohl die Mutanten nur weniger effizient einen SMC Komplex ausbilden konnten. Aus diesen Daten lässt sich folgendes Modell ableiten: ATP Bindung führt zur Dimerisierung der SMC Kopfdomänen, wodurch DNA im Ring eingeschlossen wird. Dissoziation von DNA könnte über ATP Hydrolyse erfolgen. Gelfiltrationsexperimente legen nahe, daß ScpA in Abwesenheit von ScpB zur Ablösung von DNA führt, wohingegen alle drei Proteine (d.h. in Anwesenheit von ScpB) einen stabilen Komplex bilden, der durch Bindung von DNA Schleifen zur Kondensation der DNA führen könnte. Somit könnte der Kondensations-Grad des Chromosoms in vivo durch die Menge von ScpB in der Zelle kontrolliert werden.