Molekulare Untersuchungen zur Spezifität von Polyketidsynthasen aus Dictamnus albus L. und Ruta graveolens L.

Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Funktionsweise von Polyketidsynthasen (PKS) zu leisten. Hierzu wurden Mutagenesestudien sowie biochemische Untersuchungen an Chalkonsynthase (CHS) und Acridonsynthase (ACS) aus Ruta graveolens durchgeführt. N...

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Main Author: Schreiner, Stephan
Contributors: Prof. Dr. U. Matern (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2004
Pharmazeutische Biologie
Subjects:
ACS
CHS
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Funktionsweise von Polyketidsynthasen (PKS) zu leisten. Hierzu wurden Mutagenesestudien sowie biochemische Untersuchungen an Chalkonsynthase (CHS) und Acridonsynthase (ACS) aus Ruta graveolens durchgeführt. Neben den bereits vorliegenden Enzymen aus Ruta sollte die Klonierung weiterer PKS aus Dictamnus albus Vergleiche in einem homologen System ermöglichen. Die Umwandlung der Ruta-ACS in eine funktionelle CHS wurde erfolgreich abgeschlossen. Es konnte gezeigt werden, dass es mit nur drei Mutationen möglich ist, die ACS-Aktivität auf wenige Prozent des ursprünglichen Umsatzes zu senken und gleichzeitig die Fähigkeit zur Bildung des Naringeninchalkons deutlich zu steigern, so dass dies nun die Hauptaktivität der hergestellten Mutante ist. Der umgekehrte Weg, die Umwandlung der CHS in eine ACS, gestaltete sich schwieriger. Es wurden zahlreiche Hinweise auf notwendige Bedingungen für diesen offensichtlich komplizierteren Weg erarbeitet. So konnten bei der Mutante Rk1 unter bestimmten Bedingungen eine geringe ACS-Aktivität gemessen werden. Des Weiteren zeigten Hemmtests, dass die Bindung des Startsubstrats N-Methylanthraniloyl-CoA in allen CHS-Mutanten möglich ist, im Gegensatz zur Wildtyp-CHS. Die folgende Charakterisierung zeigte, dass die Mutanten Rk1 und Rk2 in erhöhtem Maße Anthraniloyl-CoA, das postulierte Startsubstrat der Hydroxychinolonsynthase (HQS), umsetzen. Erste Hinweise deuten darauf hin, dass die vorgenommenen Mutationen der CHS nicht nur zur teilweisen Umwandlung in eine ACS geführt haben, sondern möglicherweise auch zu einer HQS. Mit der Klonierung und funktionellen Expression der Chalkonsynthase aus Diptam steht eine weitere PKS aus der Familie der Rutaceae zur Verfügung. Der Vergleich mit bereits bekannten Sequenzen erbrachte Hinweise auf weitere Sequenzstellen, durch deren Austausch die bisher unvollständige Umwandlung der CHS in eine Acridonsynthase erreicht werden könnte. Die noch ausstehende Klonierung der HQS wird dazu beitragen, die Fragen, die sich aus den unterschiedlichen Substratspezifitäten der untersuchten Enzyme und Mutanten ergeben haben, zu beantworten.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2004.0127