Role of the Kinesin-like Protein KipB in Aspergillus nidulans

Molecular motors are protein machines, which power almost all forms of movement in the living world. Among the best known are the motors that hydrolyze ATP and use the derived energy to generate force. They are involved in a variety of diverse cellular functions as vesicle and organe...

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Main Author: Rischitor Patricia Elena
Contributors: Fischer, Reinhard (HD Dr) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2004
Biologie
Subjects:
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Table of Contents: Molekulare Motoren sind Maschinen, die fast alle Bewegungsvorgänge in lebenden Organismen antreiben. Die am besten untersuchten Motoren hydrolysieren ATP und nutzen die Energie, um Kraft zu erzeugen. Sie sind an einer Vielzahl von zellulären Funktionen beteiligt, wie z.B. dem Vesikel- und Organelltransport, der Steuerung der Cytoskelettdynamik, der Morphogenese, dem polaren Wachstum, Zellbewegungen, der Spindelbildung, der Chromsomenbewegung, der Zellkernfusion und der Singaltransduktion. Drei Superfamilien von molekularen Motoren, Kinesin, Dynein und Myosin, sind sehr gut untersucht. Diese Motoren benutzen Mikrotubuli (im Falle von Kinesin und Dynein) oder Aktinfilamente (im Falle von Myosin) als Schienen, um Cargoes in der Zelle zu transportieren. Die Analyse von pilzlichen Genomen ergab das Vorhandensein von mindestens 10 verschiedenen Kinesinen in filamentösen Pilzen, von denen einige nicht in der Bäckerhefe vorkommen. Eine BLAST-Suche der genomischen A. nidulans Datenbank am Whitehead Center for Genome Research (Cambridge, USA) mittels der Motordomäne von konventionellem Kinesin (KinA) aus A. nidulans ergab elf mögliche Kinesinmotoren, die in neun der elf Familien eingruppiert werden konnten. Interessanterweise wurden zwei Vertreter der Unc104-Familie gefunden und ein A. nidulans-Kinesin konnte in keine der beschriebenen Familien eingeordnet werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das kinesin-ähnliche Protein, KipB, in Aspergillus nidulans untersucht. KipB gehört zur Familie der Kip3 Kinesine. Diese Familie besitzt einen Vertreter in Saccharomyces cerevisiae (Kip3, das namensgebende Kinesin), zwei in Schizosaccharomyces pombe, Klp5 und Klp6 und einen in Drosophila, Klp67A, das einzige bekannte Kinesin dieser Familie in höheren Eukaryoten. Kip3-Kinesine sind an der Mikrotubulidepolymerisierung beteiligt, und werden für die Chromsomentrennung während der Mitose und Meiose benötigt. Das kipB-Gen wurde im Genom von A. nidulans deletiert und der Phänotyp untersucht. Das Gen war nicht essentiell für das vegetative Wachstum oder die asexuelle oder sexuelle Differenzierung. In der Mutante war allerdings die Dynamik aller Mikrotubuli in der Zelle, wie z.B. der interphase, cytoplasmatischen, der mitotischen und der astralen Mikrobutuli gestört. DkipB-Mutanten waren weniger empfindlich gegenüber dem mikrotubuli-destabilisierenden Agens Benomyl und das Mikrotubulicytoskelett der Zellen erschien verändert. Interessanterweise war die Spindelpositionierung und die Spindelmorphologie stark beeinträchtigt. Die Spindeln waren sehr mobil und bewegten sich über lange Strecken im Cytoplasma, wobei sie sich teilweise aneinander vorbei bewegten. In 64 % der Fälle erschien die Spindel stark gebogen. Der Verlauf der Mitose war verlangsamt und cytoplasmatische Mikrotubuli waren auch während der Mitose zu sehen, obwohl diese in Wildtypzellen depolymerisiert werden. DkipB-Mutantenstämme zeigten eine erhöhte Instabilität der diploiden Zellkerne, was wiederum eine Rolle von KipB in der Mitose belegt. Ausserdem wurde eine genetische Interaktion mit einer Mutation in einem weiteren Kinesingen, bimC4, gefunden. Das KipB-Protein wurde durch eine N-terminale GFP-Fusion subzellulär in einer punktförmigen Verteilung entlang von cytoplasmatischen Mikrotubuli in Interphasezellen und an Spindel- und astralen Mikrotubli während der Mitose, lokalisiert. Die GFP-KipB Punkte bewegten sich unabhängig voneinander entlang der Mikrotubuli. Diese Bewegung könnte durch eine eigene Motoraktivität oder durch andere Motoren hervorgerufen werden. Wenn das Protein zu den Mikrotubuli-Plusenden gelangt, depolymerisiert es die Filamente. C-terminal verkürzte Versionen von KipB, die mit GFP fusioniert wurden, lokalisierten gleichmäßig entlang der Mikrotubuli.