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Theoretische und experimentelle Untersuchungen zur Inhibition des Enzyms Aldose Reduktase
Thema der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Inhibition des Enzyms Aldose Reduktase. Eine Besonderheit dieses Enzyms liegt in der ausgeprägten Anpassungsfähigkeit der Bindetasche bei der Ligandenbindung. Das Ausmaß dieser Rezeptorflexibilität wurde durch den ausführlich...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2003
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Thema der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung
der Inhibition des Enzyms Aldose Reduktase. Eine Besonderheit
dieses Enzyms liegt in der ausgeprägten Anpassungsfähigkeit der
Bindetasche bei der Ligandenbindung. Das Ausmaß dieser
Rezeptorflexibilität wurde durch den ausführlichen Vergleich
bekannter Kristallstrukturen und mit Hilfe von
molekulardynamischen Simulationen untersucht. Beim Vergleich
der bekannten Kristallstrukturen zeigte sich, dass bislang nur
vier unterschiedliche ?Hauptkonformationen? kristallographisch
beobachtet wurden. Als Startstruktur für die MD-Simulationen
wurde die Geometrie der Kristallstruktur der humanen Aldose
Reduktase im Komplex mit dem Inhibitor IDD594 verwendet. Bei
zwei der drei Simulationen wurde der Ligand zuvor aus der
Startstruktur entfernt. Die verschiedenen MD-Simulationen waren
in Lage, eine Vielzahl weiterer Konformationen zu generieren,
die ?Zwischenzustände? der bereits bekannten Konformationen
darstellen. Dies zeigt, wie wertvoll MD-Simulationen zur
Generierung eines Ensembles relevanter Proteinkonformationen
sein können, gerade bei Ziel-Proteinen für die nur sehr wenige
Kristallstrukturen zur Verfügung stehen. Ein Ziel der
vorliegenden Arbeit war die Suche nach neuen Inhibitoren der
Aldose Reduktase. Das virtuelle Screening wurde dabei zunächst
auf die in der hochaufgelösten IDD594-Komplexstruktur
beobachtete Proteinkonformation beschränkt. In diesem Ansatz
wurde also die Flexibilität des Rezeptors vernachlässigt. Die
Vorteile der IDD594-Komplexstruktur liegen (a) in der hohen
Auflösung, die exakte Informationen über die
Protonierungszustände von Protein und Ligand liefert, und (b)
in dem Vorliegen einer hydrophoben Spezifitätstasche, deren
Besetzung zu einer hohen Affinität und Spezifität der Liganden
gegenüber eng verwandten Enzymen (wie z.B. der Aldehyd
Reduktase) führt. Die Bindetasche wurde einer Hot Spot-Analyse
unterzogen, um aus den dabei identifizierten bevorzugten
Wechselwirkungsbereichen eine Pharmakophor-Hypothese
abzuleiten, die für eine 3D-Datenbanksuche verwendet wurde.
Abschließend wurden die Kandidatenmoleküle flexibel in die
Bindetasche eingepasst und einer visuellen Inspektion
unterzogen. Ebenfalls untersucht wurde, inwieweit es ein Ligand
basierender Ansatz erlaubt, die Flexibilität des Rezeptors bei
der virtuellen Datenbanksuche zu berücksichtigen. Die Idee war,
bekannte Inhibitoren der Aldose Reduktase als Abbild der
entsprechenden Proteinkonformationen zu verwenden. Die hier
berücksichtigten Inhibitoren sind Stellvertreter für drei der
vier zuvor erwähnten ?Hauptkonformationen? der Aldose
Reduktase. Aus der Überlagerung der Inhibitoren wurde eine
Pharmakophor-Hypothese abgeleitet und für die Datenbanksuche
verwendet. Anschließend wurden die Inhibitoren vereinigt und
als Referenz für die paarweise Überlagerung der
Kandidatenmoleküle verwendet. Aus beiden Datenbanksuchen
konnten neue Inhibitoren der Aldose Reduktase mit Affinitäten
im mikromolaren Bereich identifiziert werden. Das Ziel der
durchgeführten virtuellen Datenbanksuchen war,
Leitstruktur-ähnliche Verbindungen zu finden, deren Affinität
in weiteren Design-Zyklen optimiert werden kann. Ein Beispiel
dafür ist die Derivatisierung eines bereits bekannten
Inhibitors. Das beste Derivat zeigt eine 30fach höhere
Affinität als die Ausgangsverbindung. Die Struktur dieses
Inhibitors im Komplex mit humaner Aldose Reduktase konnte
aufgeklärt werden. Dabei wurde ein neuer Bindungsmodus
beobachetet, bei dem ein Citrat-Molekül die Wechselwirkung des
Inhibitors mit dem Protein verbrückt. Die Analyse dieser
Wechselwirkungen wird in der Zukunft als Grundlage für eine
neue Design-Strategie zur weiteren Verbesserung der Affinität
dienen. Dies unterstreicht die Bedeutung des Zusammenwirkens
von Computermethoden und Röntgenkristallographie bei der
Entwicklung neuer Inhibitoren. Des Weiteren wurden im Rahmen
dieser Arbeit ITC-Messsungen bei pH 8,0 und bei 25°C mit einer
Reihe von AR-Inhibitoren durchgeführt, um ein thermodynamisches
Profil der Bindung des jeweiligen Inhibitors zu erhalten. Nach
der Berücksichtigung von Korrekturtermen für die Ioniserung des
Puffers und funktioneller Gruppen des Liganden, war eine
strukturbezogene Interpretation der erhaltenen
thermodynamischen Daten möglich. Anhand der in Abhängigkeit von
dem Oxidationszustand des Kofaktors beobachteten
Protonierungsänderungen bei der Ligandenbindung konnten
Rückschlüsse auf den Liganden-Bindungsmechanismus gezogen
werden. |
|---|---|
| DOI: | 10.17192/z2004.0062 |