Identifikation und Analyse genregulatorischer Elemente des hypoxieinduzierbaren Faktors 2 alpha der Maus

Der Hypoxie-induzierbare Faktor 2 alpha ist ein vorwiegend in Endothelzellen exprimierter Transkriptionsfaktor und wird als wichtiger Regulator der Genexpression des Vaskulären Endothelzellwachstumsfaktors (VEGF) und seines Rezeptors KDR/Flk-1 diskutiert, die als Schlüsselmoleküle der Angiogenese ge...

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Main Author: Lanz, Stephan
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2003
Klinische Zytobiologie und Zytopathologie
Subjects:
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Description
Summary:Der Hypoxie-induzierbare Faktor 2 alpha ist ein vorwiegend in Endothelzellen exprimierter Transkriptionsfaktor und wird als wichtiger Regulator der Genexpression des Vaskulären Endothelzellwachstumsfaktors (VEGF) und seines Rezeptors KDR/Flk-1 diskutiert, die als Schlüsselmoleküle der Angiogenese gelten. Hierin gleicht er dem ebenfalls endothelial exprimierten Ets-1 Transkriptionsfaktor. Ziel der Arbeit war es, die regulatorischen Sequenzen des HIF-2 alpha-Gens der Maus zu identifizieren und hierin diejenigen Elemente aufzufinden, die für die endotheliale Expression des Transkriptionsfaktors verantwortlich sind. Mit einer cDNA Sonde, komplementär zur 5?-untranslatierten Region der Maus HIF-2 alpha mRNA wurde aus einer genomischen Phagenbibliothek ein genomischer Klon isoliert, der einen 4,7 kp großen Bereich des HIF-2 alpha-Gens enthielt, welcher das erste Exon beinhaltete. Der 3383 bp lange Abschnitt stromaufwärts des Start-ATGs wirkte als Promotor für ein heterologes Reportergen (Luciferase) nach Transfektion in verschiedenen eucaryoten Zellkulturzellen. Die relativ stärkste Aktivität entfaltete der Promotor in humanen Nabelschnurendothelzellen. Der Transkriptionsstart wurde mittels Primer Extension, RNase-Protektionsexperimenten und PCR bei Nukleotid -578 bezogen auf das Start-ATG gefunden. Eine TATA-Box wurde bei Nukleotid -37 (bezogen auf den Transkriptionsstart) gefunden und durch Mutagenese ihre Funktion nachgewiesen. Durch Deletionsanalyse wurde gezeigt, daß ein Abschnitt von 1,1 kb stromaufwärts des Transkriptionsstartes hinreichend positiv aktive Elemente enthielt, um als Promotor zu fungieren. Von den zahlreichen potentiellen Transkriptionsfaktorbindungsstellen im HIF-2 alpha-Promotor wurden diejenigen für HIFs und Ets-Transkriptionsfaktoren näher untersucht. Beide Transkriptionsfaktoren transaktivierten HIF-2 alpha-Promotor-Reporterkonstrukte und zeigten stark kooperative Wirkung. Durch DNaseI footprint-Analyse konnte gezeigt werden, daß die für Ets und HIF benachbart liegenden potentiellen Bindungsstellen bei -935 und -910 im HIF-2 alpha-Promotor durch Proteine aus endothelialen Kernextrakten besetzt werden, nicht jedoch aus nicht endothelialen Kernextrakten. Die Funktionalität der HIF-Bindungsstelle konnte ferner durch Mutagenese nachgewiesen werden. In Transgenexperimenten trieb ein 2380 bp großes Promotorfragment stark die Expression von E. coli beta-Galaktosidase als Reportergen in neuronalen Geweben des Mausembryos an. Auch ein Reportergenkonstrukt, das darüberhinaus einen 1,27 kb großen Intron1-Bereich des HIF-2 alpha-Gens enthielt, zeigte dieselbe neuronale Expression. Nach Hinzufügen weiterer Abschnitte aus dem ersten Intron (5,64 kb) verschwand die neuronale Expression. Eine endotheliale Expression wurde jedoch nicht gewonnen. Es kann hieraus gefolgert werden, daß der HIF-2 alpha-Promotor stark positiv wirkende Elemente enthält, die durch endotheliale Transkriptionsfaktoren erkannt werden, wobei HIF-2 alpha seine eigene Transkription aktiviert. Diejenigen Elemente, die letztlich für eine endotheliale Expression des Transkriptionsfaktors in vivo verantwortlich sind, dürften aber außerhalb des hier analysierten Bereichs liegen.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2003.0692