Überführung der Faktor Xa Bindetasche in Trypsin: Ein Modellsystem für das Verständnis von Protein ? Ligand ? Wechselwirkungen und zur Charakterisierung von Selektivitätsdeterminanten

Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, ein leistungsfähiges Expressions- und Rückfaltungssystem für die Produktion rekombinanten Rindertrypsins zu etablieren und Proteinmengen von 5 bis 15 mg pro Trypsinvariante im Labormaßstab bei relativ geringen Kosten zu erhalten. Mit Hilfe dieses Systems und...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Rauh, Daniel (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2003
Pharmazie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, ein leistungsfähiges Expressions- und Rückfaltungssystem für die Produktion rekombinanten Rindertrypsins zu etablieren und Proteinmengen von 5 bis 15 mg pro Trypsinvariante im Labormaßstab bei relativ geringen Kosten zu erhalten. Mit Hilfe dieses Systems und der verwendeten zielgerichteten Mutagenese konnte die Bindetasche der trypsinähnlichen Serinprotease Faktor Xa sukzessive auf Trypsin übertragen werden. Vierzehn bovine Trypsinvarianten wurden mit den vorgestellten Methoden kloniert, exprimiert, renaturiert und mit Enterokinase zu biologisch aktiven Enzym umgesetzt. Jede der Varianten konnte kinetisch und strukturell im Komplex mit mehreren, in ihren Strukturen z.T. sehr diversen Inhibitoren charakterisiert werden. Mittels der Methode des Molekularen Ersatzes konnten Röntgenkristallstrukturen von Trypsinvarianten in zwei neuen Raumgruppen gelöst werden. Insgesamt sind im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich die Raumstrukturen von über 44 Trypsin- bzw. mutagenisierten Trypsin-Varianten mit Liganden vermessen und aufgeklärt worden. Stand am Anfang der Arbeit das Vorhaben, Bindetaschen strukturell nicht charakterisierter Rezeptoren für das strukturbasierte Wirkstoffdesign auf verwandte Proteine zu übertragen, so konnten am Ende der Arbeit durch die große Anzahl an Röntgenkristallstrukturen und kinetischen Daten die Fragestellung in Richtung des Verständnis physikochemischer Zusammenhänge von Protein-Ligand-Wechselwirkungen, besonders im Hinblick auf die Charakterisierung selektivitätsbestimmender Faktoren und Fragen der Proteinflexibilität in Bindetaschen, erweitert werden. Die zunächst eingeführten Variationen im Bereich der 99- und 190-Schleife resultierten strukturell und kinetisch in einem Trend hin zu Faktor Xa. Die kinetische Untersuchung der Substratspezifität mit Peptidbibliotheken unterstreicht die zunehmende Präferenz von Arg und Gly in den Positionen P1 und P2. Das Einführen der Ser-Ser-Phe-Ile-Sequenz in die 175-Schleife setzt diesen Trend nicht in der erwartenden Weise fort, sondern zeigt im Vergleich zu den Inhibitionswerten gegenüber Trypsin keine signifikanten Unterschiede. Die strukturelle Charakterisierung präsentiert die eingeführte 175-Schleife in einer unerwarteten Orientierung, der down-Konformation. Der Teil der Bindetasche, die sogenannte ?hydrophobe-aromatische Box?, die für die Adressierung durch Faktor Xa-spezifische Inhibitoren essentiell ist, wurde wiedererwartend nicht voll ausgebildet. Zur genaueren Charakterisierung wurden vier weitere Variationen in Position 174 der bereits veränderten 175-Schleife eingeführt. In Abhängigkeit von den verwendeten Kristallisationsbedingungen und den erhaltenen Packungsmustern sowie den gebundenen Liganden wurde neben der down- und up-Konformation noch eine dritte, die super-up-Konformation, gefunden. Anhand der nachgewiesenen strukturellen Plastizität dieses Bereiches kann das extrem unterschiedliche kinetische Verhalten der Trypsin-Varianten mit modifizierter 175-Schleife erklärt werden. In zwei abschließenden Mutationsstudien wurde Ser217 (Trypsin) durch Glu217 (Faktor Xa) in den Trypsinvarianten X(SSFI)bT und X(triple)bT ersetzt. Neben den beschriebenen Abhängigkeiten der Konformationen der 175-Schleife von der Kristallpackung und dem gebundenen Ligand, zeigen beide Glu217-Varianten einen deutlichen Sprung in ihrem kinetischen Verhalten hin zu Faktor Xa. Als eine der entscheidenden Strukturen zeigt der Komplex aus X(triple.Glu)bT und der Zeneca-Verbindung (Tabelle 1?4) die weitgehende Analogie der Bindetasche dieser Variante im Vergleich zu der Bindetasche von Faktor Xa. Das Ziel, die Bindetasche von Faktor Xa auf das verwandte Enzym Trypsin zu übertragen, wurde somit strukturell erreicht. Trotz dieser strukturellen Übereinstimmungen bleibt unter den enzymkinetisch charakterisierten Inhibitoren zumindest für die Faktor Xa selektive Zeneca-Verbindung eine Diskrepanz von einer Größenordnung. Für dieses Beispiel helfen jedoch die mannigfachen Röntgenkristallstrukturen, die im Rahmen dieser Arbeit aufgeklärt wurden, diese Diskrepanz zwischen dem Target-Protein Faktor Xa, der Rattentrypsinvariante X(triple)rT und den beiden Rindertrypsinvarianten X(triple)bT, X(triple.Glu)bT durch ein Mehrstufen-Modell als Beiträge für die strukturelle Adaption der Bindetasche aufzubringende Energie zu erklären. Das Bild einer einzelnen Komplexstruktur reflektiert in den gezeigten Beispielen nur ungenügend die Vorgänge, die durch Bindung des Inhibitors in der Bindetasche zur Hemmung der Enzymaktivität führen und verdeutlicht die aktuellen Herausforderungen im Bereich des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die etablierten Methoden und Ergebnisse dieser Arbeit bilden eine solide Grundlage für die unbedingt erforderliche Erforschung selektivitäts- und spezifitätsbestimmender Faktoren an der Schnittstelle zwischen Rezeptor und Ligand.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2003.0329