Kontinuierliche Messung der zellgetriggerten Thrombinbildung Entwicklung einer Methode zur Bestimmung der prokoagulatorischen Aktivität von Zellen

Als hämostatisches Gleichgewicht wird das ausgewogene Zusammenspiel verschiedener komplexer Prozesse und Systeme zur Aufrechterhaltung der Fließfähigkeit des Blutes im Gefäßsystem einerseits und der Gerinnbarkeit nach Verletzung andererseits bezeichnet. Zur Hämostase tragen verschiedene Systeme bei:...

Ausführliche Beschreibung

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1. Verfasser: Zielosko, Annett
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2003
Pharmazeutische Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Zusammenfassung:Als hämostatisches Gleichgewicht wird das ausgewogene Zusammenspiel verschiedener komplexer Prozesse und Systeme zur Aufrechterhaltung der Fließfähigkeit des Blutes im Gefäßsystem einerseits und der Gerinnbarkeit nach Verletzung andererseits bezeichnet. Zur Hämostase tragen verschiedene Systeme bei: sowohl Blutgefäße mit Endothel und Subendothel als auch Thrombozyten. Die Gerinnungsfaktoren sowie das fibrinolytische System jeweils mit den entsprechenden Inhibitoren sind eng verknüpft mit der vaskulären und zellulären Komponente. Nach Verletzung eines Blutgefäßes kommen die plasmatischen Gerinnungsfaktoren in Kontakt mit extravaskulärem Tissue Factor (TF). TF, auch bekannt als CD142, Gewebsthromboplastin oder Faktor III, ist der potenteste Aktivator des Gerinnungssystems (extrinsische Gerinnungsaktivierung). Zur Bestimmung der TF-Expression von Zellen werden verschiedene Methoden herangezogen. Durch Präparation der TF-mRNA kann die Induktion der TF-Synthese nachgewiesen werden, damit ist jedoch eine Aussage über das tatsächlich vorhandene Protein nicht möglich. Die ELISA-Technik ermöglicht eine quantitative Bestimmung des TF-Antigens. Dazu ist jedoch eine Zelllyse erforderlich, intrazellulärer und membranständiger TF können nicht mehr unterschieden werden. Durch Markierung des TF-Antigens auf intakten, fixierten Zellen kann TF immunhistochemisch nachgewiesen oder durch FACS-Analyse in markierten Zellsuspensionen quantitativ bestimmt werden. Die beschriebenen immunologischen Methoden erfassen jedoch nicht die Aktivität des TF-Proteins, inaktives Protein wird mitbestimmt. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer einfachen und leicht durchzuführenden Methode zur Bestimmung der prokoagulatorischen Aktivität von Zellen. Als Maß dafür sollten nicht TF-mRNA- oder Antigengehalt der Zellen dienen, sondern die Gerinnungsaktivität intakter Zellen als Summe aller diesen Prozess beeinflussenden Faktoren bestimmt werden. Es wurde gezeigt, dass die prokoagulatorische Aktivität intakter Endothelzellen und damit die TF- Präsentation sowohl von der Konzentration und als auch von der Einwirkungsdauer einer stimulierenden Substanz (hier Tumor Nekrose Faktor ?) abhängt. Durch Hemmversuche mit antiTF-Antikörpern, inaktiviertem FVIIa und C1-Esterase-Inhibitor konnte allerdings nachgewiesen werden, dass ein gewisser Anteil der zellbedingten Thrombinbildung nicht durch die TF-bedingte extrinsische Gerinnungsaktivierung zustande kommt, sondern über den intrinsischen Weg abläuft. Die direkte chromogene Methode wurde auch für die Messung der prokoagulatorischen Aktivität anderer Zellarten eingesetzt. Sie war insbesondere bei glatten Muskelzellen (smooth muscle cells, SMC) zur Bestimmung der Gerinnungsaktivität sehr gut geeignet. Es zeigte sich dabei, dass das Messsignal in Gegenwart intakter SMC deutlich stärker von TF abhängig war als bei HUVEC. Offenbar spielt bei SMC die intrinsische Gerinnungsaktivierung eine untergeordnete Rolle. Außerdem konnte die Gerinnungsaktivität von Mikropartikeln nachgewiesen werden, die von Endothelzellen in das überstehende Medium abgegeben werden. Durch Austausch des Chromophors am Thrombinsubstrat gegen eine fluorogene Gruppe wurde die Methode im Anwendungsspektrum erweitert. Mit dem fluorogenen Substrat kann auch die prokoagulatorische Aktivität von Zellen in Suspensionen ermittelt werden. Damit ist nun auch die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen möglich. Die fluorogene Bestimmung der Thrombinbildung gestattet ebenfalls die Messung in plättchenreichem Plasma.