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Titel:Die Rolle von Blow und Drp1 bei der Auflösung des Präfusionskomplexes am Zell-Zell Kontakt während der Myoblastenfusion von Drosophila
Autor:Papendieken, Michaela
Weitere Beteiligte: Önel, Susanne-Filiz (Dr.)
Veröffentlicht:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0502
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0502
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-05029
Publikationsdatum:2019-11-05
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):The role of Blow and Drp1in the dissolution of prefusionkomplex at the cell-cell contact during Drosophila myoblast fusion

Dokument

Schlagwörter:
Shark, myoblast fusion, Drp1, Mitochondrien, Drp1, Drosophila, Blow, Drosophila, Myoblastenfusion, Blow, Shark

Zusammenfassung:
In Drosophila fusionieren während der embryonalen Myogenese Founderzellen (FC) und fusionskompetente Myoblasten (FCM) um die Körperwandmuskulatur zu bilden (Onel und Renkawitz-Pohl 2009). Dabei kommt es nach den ersten Fusionen zur Ansammlung von elektronendichten Vesikeln an der Kontaktstelle, welche den Präfusionskomplex bilden. Nach Erkennung und Adhäsion der FC mit der FCM erfolgt die Etablierung eines multimeren Signalkomplexes, welcher als fusion-restricted myogenic adhesive structure (FuRMAS) bezeichnet wird. Eine kennzeichnende Eigenschaft dieser ist eine, auf Seiten der FCM, drastische Reorganisation von F-Aktin am Zellkontakt (Kesper et al. 2007; Onel und Renkawitz-Pohl 2009). Das FCM-spezifische Protein Blown fuse (Blow) ist für die Myoblastenfusion essentiell und an der Reorganisation von F-Aktin am Zellkontakt beteiligt (Jin et al. 2011; Schroter et al. 2004). Ultrastrukturelle Analysen zeigen, dass blow-Mutanten während der Etablierung des Präfusionskomplexes stoppen wohingegen Mutanten für die F-Aktin Reorganisation Wasp und Wip erst während der Vesikularisierung der Membranen stoppen (Berger et al. 2008; Doberstein et al. 1997; Massarwa et al. 2007). Dies wirft die Frage auf, ob Blow die F-Aktin Bildung und die Freisetzung der elektronendichten Vesikel koordiniert. Über einen globalen Hefe-2-Hybrid Screen wurden zwei neue potentielle Interaktionspartner Shark und Drp1 identifiziert. In dieser Studie wurde die Funktion von Shark und Drp1 während der Myoblastenfusion adressiert. Die Interaktion zwischen Shark und Blow konnte mit Hilfe von Hefe-2-Hybrid Interaktionstest nicht auf eine definierte Region des Proteins beschränkt werden. Defekte im Embryo bei der Expression von shark-Deletionen, denen entweder die Ank-Repeats oder beide SH-Domänen fehlen weisen darauf hin, dass Shark an der Fusion beteiligt ist. Eine Expression von UAS-shark Δ kin-mcherry in der adulten Flugmuskulatur führt zu einer deutlich reduzierten durchschnittlichen Flugfähigkeit. Dies ist ein weiterer Hinweis auf eine Beteiligung von Shark an der Myoblastenfusion. Basierend auf Daten zu Syk dem Vertebraten Homolog von Shark, während der B cell receptor (BCR) Aktivierung, wurde untersucht, ob eine direkte oder genetische Interaktion zwischen dem IgSF Sns und Shark besteht (Kroczek et al. 2010). Eine direkte Interaktion konnte nicht gezeigt werden, allerdings scheint eine genetische Interaktion zu bestehen. Dies legt nahe, dass Shark ähnlich wie dies für die BCR Aktivierung gezeigt werden konnte, wirken könnte. 1 Einleitung 4 Die GTPase-Domäne von Drp1 ist essentiell für die Vermittlung der Interaktion zwischen Drp1 und Blow im Hefe-2-Hybrid System. Ein Dosisexperiment an drp11, blow2-Doppelmutanen weist auf eine genetische Interaktion zwischen Drp1 und Blow hin. Auch führt die Expression von UAS-drp1 Δ GED-mcherry im Gegensatz zur Expression von UAS-drp1 Δ GTPase-mcherry im Embryo sowie während der Entwicklung der adulten Flugmuskulatur zu stärkeren Defekten. In vorliegenden Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass eine Inhibition von Drp1 in primären Mausmyoblasten mittels Mdivi-1 Inkubation Dosis-abhängig zu einer drastischen Reduktion in der Fusionseffizienz führt. Dies liefert weitere Hinweise auf eine mögliche Beteiligung von Drp1während der Fusion. Drp1 ist ein Hauptregulator der mitochondriellen Teilung (Verstreken et al. 2005). Eine Lokalisationsstudie der Mitochondrien Verteilung in sns20-15-, duf, rst-, sing22-, rols117- und ketteJ4-48-Mutanten konnte zeigen, dass die Lokalisation dieser dynamisch während der Fusion verläuft. Mitochondrien lokalisieren während der Migration und einer frühen Anheftung der Myoblasten eher in der Spitze der Zelle und der Anheftungsstelle, während einer festen Adhäsion allerdings eher abseits von Zell-Zell Kontakt. Der Verlust von marf, einem Gen, welches am Transport von Mitochondrien beteiligt ist führt zu einem deutlichen Fusionsdefekt. Dies deutet darauf hin, dass der Transport von Mitochondrien für die Fusion wichtig zu sein scheint. Eine Expression von UAS-shibire-GED Δ PRR-mcherry weist darauf hin, dass möglicherweise die GTP Hydrolyse eine Rolle während der embryonalen Myogenese spielt. Rab4 und Rab11 spielen eine Rolle in der Homöostase der Mitochondrien (Caza et al. 2014; Landry et al. 2014). Eine Expression von volle-länge (fl), sowie potentiell dominant-negativ und konstitutiv-aktiv wirkender rab4- und rab11-Konstrukte im Embryo führt zu leichten Defekten. Dies könnte ein Hinweis auf die mögliche Beteiligung von Rab4 und Rab11 an der Aufrechterhaltung der mitochondriellen Homöostase während der Fusion sein.

Summary:
In Drosophila, founder cell (FC) and fusion competent myoblasts (FCM) fuse during embryonic myogenesis to form the body wall musculature (Onel und Renkawitz-Pohl 2009). After the first fusion events an accumulation of electron-dense vesicles form the prefusion complex at the cell contact. A vesicularisation of opposing membranes occurs in order to incorporate the FCM into the FC/growing myotube. After recognition and adhesion a multimere signalling complex is established, called fusion-restricted myogenic adhesive structure (FuRMAS). One characteristic feature is the drastic reorganisation of F-actin at the cell-contact in FCM (Kesper et al. 2007; Onel und Renkawitz-Pohl 2009). The FCM-specific protein Blown fuse (Blow) is essential for myoblast fusion and is involved in the reorganisation on F-actin at the side of fusion (Jin et al. 2011; Schroter et al. 2004). Ultrastructural analysis of blow-Mutants show that they stop myoblast fusion during the establishment of the prefusion complex (Doberstein et al. 1997), whereas mutants of the F-actin reorganisation Wasp and Wip stop later during the vesicularisation of membranes (Berger et al. 2008; Massarwa et al. 2007). This raises the question, whether Blow coordinates f-actin formation and the release of electron-dense vesicles. A global yeast-2-hybrid screen identified Shark and Drp1 as newly potential interaction partner. In the present study the function of Shark and Drp1 during myoblast fusion was addressed. By using the yeast-2-hybrid, system the region of interaction between Shark and Blow could not be specified. Expression of shark-deletions missing either the Ank-repeats or both SH2-domains indicate that Shark is involved in the fusion process. Expression of UAS-shark Δ kin-mcherry in the adult flight muscles leading to distinct reduction in the average flight ability. This supports further the idea that Shark might be involved in myoblast fusion. Based on data of Syk the vertebrate homologue of Shark, during the B cell receptor (BCR) activation, it was analysed if there is a direct or genetic interaction between Shark and the IgSF Sns (Kroczek et al. 2010). Yeast-2-Hybrid analysis could not identify an interaction but doses experiments with the double mutants showed a genetic interaction. Indicating a similar function of Shark as shown for the BCR activation. The GTPase-domain of Drp1 could be shown in the yeast-2-hybrid system to be essential for the interaction between Drp1 and Blow. A dosage experiment on drp11, blow2-double mutants indicates a genetic interaction between Drp1 and Blow. The expression of 1 Einleitung 2 UAS-drp1 Δ GED-mcherry in contrast to UAS-drp1 Δ GTPase-mcherry in the embryo and the adult flight muscles leads to a stronger defect. In this study it was shown that the inhibition of Drp1 function in primary mouse myoblasts via incubation with Mdivi-1 results in a dose dependant drastic reduction in fusion-efficiency. Indicating further an involvement of Drp1 during fusion. Drp1 is a master regulator of mitochondrial division (Verstreken et al. 2005). A mitochondrial localisation study in sns20-15-, duf, rst-, sing22-, rols117-, ketteJ4-48 and blow2-mutants showed that mitochondria localise dynamic during fusion. During migration and early attachment mitochondria localise increased in the leading edge of the cell and the side of fusion, during late attachment the mitochondria vanished from the side of fusion. The loss of marf, a gene involved in mitochondrial trafficking, leads to a distinct fusion defect. This indicates that the transport of mitochondria seems to be important for the fusion. The expression of UAS-shibire-GED Δ PRR-mcherry indicates a role of the GTP hydrolysis during embryonic myogenesis. Rab4 and Rab11 play a role during mitochondrial homeostasis (Caza et al. 2014; Landry et al. 2014). An expression of a full-length (fl), as well as a potential dominant-negative and constitutive-active rab4- and rab11-construct in the embryo results in lightly defects. An evidence of a potentially contribution of Rab4 and Rab11 in the mitochondrial homeostasis


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