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Titel:Lipodendriplexes: A promising nanocarrier for enhanced nucleic acid delivery
Autor:Tariq, Imran
Weitere Beteiligte: Bakowsky, Udo (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0490
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0490
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-04909
DDC: Pharmacology & therapeutics, prescription drugs
Titel(trans.):Lipodendriplexe: Ein vielversprechender Nanoträger für eine verbesserte Nukleinsäureabgabe

Dokument

Schlagwörter:
Zyto, Cytot, Plasmid-DNA, 3D bioprinting, Ex vivo, siRNA, Ex vivo, Dendriplexes, Gentherapie, In vivo, Lipodendriplexes, Liposomes, Apoptose, Gentherapie, Ex vivo, siRNA, Plasmid DNA, siRNA, In vivo, Herunterregulierung, In vivo, Apoptose, Dendriplexe, Dendriplexe, Liposomen, Gene therapy, Lipodendriplexe, Downregulation, Liposomen, Herunterregulierung, Lipodendriplexe, PAMAM, Apoptosis, 3D-Bioprinting, 3D-Bioprinting, PAMAM, Zyto, PAMAM, Plasmid-DNA

Summary:
The main objective of the current study was to developed an optimized system for enhanced nucleic acid delivery with minimum cytotoxicity. For efficient therapeutic gene delivery, PAMAM dendrimer, with ethylenediamine core was chosen due to its biodegradable and non-immunogenic nature. However, the cytotoxicity and unusual biodistribution by this polycationic polymeric system urged the need of protective shielding. Therefore, a non-covalent interaction of dendriplexes with lipids i.e. liposomal modification was chosen as a technique to overcome the associated drawbacks. The methodology section of the thesis deals with the preparation of liposomes, dendriplexes, lipodendriplexes, their subsequent physicochemical characterization and in vitro, in ovo and in vivo studies. In the results section, the characterization of dendriplexes has been discussed, which was the prerequisite of lipodendriplex formation. Dendriplexes formation was confirmed by gel retardation and fluorescence quenching assay. Dynamic light scattering and laser Doppler anemometry also confirmed the stable complex formation, with a desired size range suitable for cellular internalization. Based on highest pDNA transfection efficiency and appropriate cell viability profile, an N/P ratio of 12 has been chosen for complexation with the liposomal formulation. A broad range of liposomal formulations has been investigated and the influence of liposome to PAMAM ratios on surface charge and size of lipodendriplexes are described in detail. Surface morphology of the liposomes and lipodendriplexes has been analysed using atomic force microscopy and their sizes were compared with the results obtained from dynamic light scattering. Transfection studies have been discussed for different lipodendriplexes formulations. It has been observed that the DPPC:CH-PAMAM lipodendriplexes showed a significant improvement in pDNA transfection as compared to other lipodendriplexes formulations and their parent dendriplexes. The higher gene expression was also confirmed using fluorescence microscopy by GFP expression analysis. Cytotoxicity studies including MTT, ROS, lysosomal disruption and DNA damage assays has been discussed in detail. From the results, it has been depicted that the lipid modification of dendriplexes shields the terminal amino group induced toxicity and consequently improves the cell viability. Biocompatibility studies has been performed to check to the compatibility of the complexes in the presence of blood components. Heparin competition and erythrocyte hemolysis assay revealed the biocompatible nature of the lipodendriplexes. Another objective of the study was to deliver the siRNA to investigate the gene silencing effect. Knockdown experiments showed a pronounced downregulation of luciferase, GFP and MDR1 genes by lipodendriplexes compared to dendriplexes or the control siRNA groups. The role of MDR1 in cell migration and colonization of cancer cells has also been described in detail. Downregulation of MDR1 gene by lipodendriplexes exhibited significant inhibition of tumor metastasis and colonization. The knockdown effect of MDR1 gene was also investigated in 3D cell culture environment. Cell migration and ring closure assays were performed using 3D tumor spheroid and ring bioprinting model. A significant reduction in the cell migration was observed in the case of lipodendriplexes treated group. Next step was to investigate the enhanced intracellular accumulation of tyrosine kinase inhibitor (imatinib mesylate) after the downregulation of P-gp (responsible for drug efflux) and subsequent apoptosis in colon carcinoma. Apoptosis assay was done in 2D and 3D cultures using flow cytometry and live dead staining, respectively. The results of 2D culture were in agreement with the data from 3D cell cultures. Cell cycle analysis also confirmed the imatinib mesylate induced apoptosis, indicated by an arrest of Sub-G1 phase depicting an effective downregulation of P-glycoprotein by lipodendriplexes. In order to minimise the unethical use of animals, an alternative in ovo chorioallantoic membrane model (an in vivo like environment) has been used to determine the efficacy and biocompatibility of the complexes. Lipodendriplexes exhibited successful reporter gene (GFP) expression in the CAM with no toxicity observed within the CAM vasculature. After establishing the improved gene transfection and toxicity profile in in vitro conditions, in vivo biodistribution and toxicity assessment of the complexes has performed in female BALB/c mice and discussed in detail. In vivo biodistribution has revealed that encapsulation of dendriplexes with liposomes has essentially increased the cellular uptake of the complexes, which was confirmed by ex vivo imaging of the dissected organs. Acute toxicity studies showed that the lipodendriplexes treated group did not produce any change in body weight, organ to body ratio and in organ tissue histopathology. Serum biomarkers and hematological studies also revealed the biocompatibility in an in vivo environment. From the findings in this thesis, it can be concluded that development of such non-viral nano carrier system could serve for an efficient gene transfection with better safety profile, both for in vitro and in vivo therapeutics. Further in vivo studies using different pre-clinical models for specific targeted delivery against different types of cancer and genetic disorders will help to realise the therapeutic potential of this system.

Zusammenfassung:
Das Hauptziel der aktuellen Studie war die Entwicklung eines optimierten Gentransfersystems mit minimaler Zytotoxizität und maximaler Effizienz. Für einen effizienten Gentransfer dienten PAMAM-Dendrimere, die aus einem Ethylendiamin-Kern bestehen und biologisch abbaubar und wenig immunogen sind. Die Zytotoxizität und die ungewöhnliche Verteilung in biologischen Systemen erforderten jedoch eine Schutzabschirmung dieser polykationischen Polymersysteme. Die Ausnutzung von nichtkovalenten Wechselwirkungen von Dendriplexen mit Lipiden wurde als ein nützliches technologisches Instrument genutzt, um diese Nachteile zu überwinden. Der methodische Teil der Arbeit beschreibt die Herstellung von Liposomen, Dendriplexen, Lipodendriplexen und deren anschließende physikalisch-chemische Charakterisierung bis hin zu in-vitro-, in-ovo- bzw. in-vivo-Studien. Der Ergebnisabschnitt der Arbeit umfasst die Charakterisierung von Dendriplexen, welche die Voraussetzung für die Bildung von Lipodendriplexen darstellen. Die Überprüfung der Integrität der Bildung stabiler Dendriplexen wurde mit Hilfe der Gel-Retardations Chromatographie und des Fluoreszenzlöschungsassays durchgeführt. Dynamische Lichtstreuung und Laser-Doppler-Anemometrie bestätigten ebenfalls die stabile Komplexbildung in einem gewünschten Größenbereich (von unter 200 nm), der für eine optimale zelluläre Aufnahme geeignet ist. Auf Grund der höchsten pDNA-Transfektionseffizienz und einer geringen Zelltoxizität wurde ein N/P-Verhältnis von 12 für die Liposomenkomplexierung verwendet. Ein breites Spektrum liposomaler Formulierungen wurde zur Komplexierung mit Dendriplexen untersucht und der Einfluss des Liposom-PAMAM-Verhältnisses auf die Oberflächenladung und die Größe von Lipodendriplexen wurde detailliert beschrieben. Die Untersuchung der Oberflächenmorphologie der Liposomen und Lipodendriplexe fand mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie statt. Die gemessenen Durchmesser wurden mit den Ergebnissen der dynamischen Lichtstreuung verglichen. Eine breite Vielfalt an verschiedenen Lipodendriplex-Formulierungen sind hergestellt, charakterisiert und deren Transfektionsstudien diskutiert worden. Die DPPC:CH-PAMAM-Lipodendriplexe zeigten eine signifikante Verbesserung der pDNA-Transfektion im Vergleich zu anderen Lipodendriplex Formulierungen und Dendriplexen. Eine GFP-Expressionsanalyse bestätigte die erhöhte Genexpression. Untersuchungen zur Zytotoxizität, einschließlich MTT-, ROS-, Lysosomal-Disruptions und DNA-Schädigungs Assays, wurden ausführlich diskutiert. Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Lipidmodifikation, die für Zelltoxizität verantwortlichen terminalen Aminogruppen von Dendriplexen abschirmen und letztendlich zu einer erhöhten Zellüberlebensrate führen. Das Biokompatibilitätsprofil wurde untersucht, um die Verträglichkeit der Komplexe in Blutbestandteilen zu überprüfen. Der Heparin-Kompetitions- und Hämolysetest bestätigte die deutlich verbesserte Biokompatibilität von Lipodendriplexen im Vergleich zu den Dendriplexen. Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand darin, den siRNA Gen-Silencing-Effekt zu untersuchen. Im Vergleich zu Dendriplexen und zu der siRNA-Kontrollgruppe zeigten Lipodendriplexe eine ausgeprägte Herunterregulierung des Luciferase-, GFP- und des therapeutisch relevanten MDR1-Gens. Die Rolle von MDR1 bei der Zellmigration und Kolonisierung von Krebszellen wurde ebenfalls ausführlich beschrieben. Die Herunterregulierung des MDR1 Gens durch Lipodendriplexe zeigte eine signifikante Hemmung des Tumormetastasenwachstums und deren Abwanderung/Weiterverbreitung. Die Untersuchung des Knockdown-Effekts des MDR1-Gens erfolgte in einer 3D-Zellkulturumgebung, die eine ähnliche Situation wie in-vivo simuliert. Die Zellmigrations- und Ringschluss-Assays wurden unter Verwendung eines 3D-Tumor-Sphäroid- und Ring-Bioprinting-Modells durchgeführt. Eine deutliche Hemmung der Zellmigration wurde dabei festgestellt. Der nächste Schritt bestand in der Untersuchung der verstärkten intrazellulären Akkumulation des Tyrosinkinaseinhibitors (Imatinib-Mesylat) nach der Herunterregulierung von P-gp, das vornehmlich für die zelluläre Arzneimittelausschleusung verantwortlich ist, und der anschließenden Apoptose beim Kolonkarzinom. Der Apoptosetest wurde in 2D- und 3D-Kulturen unter Verwendung von Durchflusszytometrie bzw. Lebendtotfärbung durchgeführt. Die Ergebnisse der 2D-Kultur haben eine Bestätigung der in 3D-Zellkulturen erhaltenen Daten erbracht. Aus den Befunden knonnte geschlossen werden, dass nach der wirksamen Herunterregulierung von P-gp durch Lipodendriplexe die intrazelluläre Akkumulation des Wirkstoffs und anschließend die zelluläre Apoptose erhöht wurde. Die Zellzyklusanalyse bestätigte auch die durch Imatinib-Mesylat induzierte Apoptose, die durch einen Stillstand der Sub-G1-Phase angezeigt wird und eine wirksame Herunterregulierung von P-gp durch Lipodendriplexe darstellt. Um die Verwendung von Tieren in vorklinischen Experimenten zu verringern, ist eine Alternative, das sogenannte in-ovo chorio allantois Membranmodell verwendet worden, um die Exposition von Komplexen in-vivo-ähnlicher Umgebung zu untersuchen. Es wurde beobachtet, dass die Lipodendriplexe eine erfolgreiche GFP-Expression auf der CAM-Oberfläche und kein toxisches Verhalten in den CAM-Gefäßen aufwiesen. Danach konnten die Komplexe nach Festlegung des verbesserten Gentransfektions- und Toxizitätsprofils unter in-vitro-Bedingungen, in-vivo-Bioverteilung und Toxizitätsbewertung geplant und ausführlich erörtert werden. Die in-vivo-Bioverteilung zeigte, dass die Verkapselung von Dendriplexen in Liposomen die zelluläre Aufnahme der Komplexe wesentlich erhöht hat, was durch ex-vivo-Bildgebung der präparierten Organe bestätigt wurde. Studien zur akuten Toxizität wurden ebenfalls eingehend untersucht. Es konnte beobachtet werden, dass die mit Lipodendriplexen behandelte Gruppe keine Änderung des Körpergewichts, des Verhältnisses von Organ zu Körper und der Histopathologie des Organgewebes hervorrief. Serumbiomarker und hämatologische Studien zeigten auch die Biokompatibilität in einer in-vivo-Umgebung. Die Ergebnisse zeigen, dass die Entwicklung eines solchen nicht-viralen Genvehikels für eine effiziente Gentransfektion mit einem besseren Sicherheitsprofil sowohl in-vitro als auch in-vivo verwendbar wird. Weitere in-vivo-Studien mit verschiedenen präklinischen Modellen zur gezielten Therapie von verschiedenen Arten von Tumoren und genetischen Störungen könnte das therapeutische Potential diesen neuartigen Lipodendriplexen bestätigen.


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