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Titel:Inverse PPARβ/δ Agonisten: Rekrutierung von Co-Repressoren und Mechanismen der transkriptionellen Repression
Autor:Legrand, Nathalie
Weitere Beteiligte: Adhikary, Till (PD Dr.)
Veröffentlicht:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0422
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0422
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-04226
Publikationsdatum:2019-11-05
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):PPARβ/δ inverse agonists: recruitment of co-repressors and mechanisms of transcriptional repression

Dokument

Schlagwörter:
Co-Repressoren, HDAC3, RNA-Polymerase II, Kernrezeptoren, Liganden, Reinitiation, Mediator, Mediator, SMRT, reinitiation, Liganden, nuclear receptors, ini, SMRT, inverse agonists, ligands, Co-Repressoren, PPARβ/δ, NCoR, inverse Agonisten, inverse Agonisten, Transkription, Ini, HDAC3, PPARβ/δ, co-repressors, Ini, NCoR, RNA polymerase II, HDAC3, PPARβ/δ, Reinitiation, NCoR, Transkription, Kernrezeptoren, Mediator, RNA-Polymerase II, SMRT, transcription

Zusammenfassung:
Der Peroxisomen-Proliferator-aktivierte Rezeptor β/δ (PPARβ/δ) bindet als Klasse II Kernrezeptor mit seinem obligatorischen Heterodimerisierungspartner RXR an PPAR-responsive Elemente (PPREs) der DNA. Im unligierten Zustand übt PPARβ/δ durch die Rekrutierung von NCoR/SMRT-Komplexen eine basale Repression auf die Transkription seiner kanonischen Zielgene aus. Die Bindung eines Agonisten führt zur Dissoziation dieser Co-Repressoren und ermöglicht die Rekrutierung von Co-Aktivatoren, was letztlich in einer Aktivierung der Transkription resultiert. Synthetische inverse Agonisten bewirken hingegen eine verstärkte Repression, die eine Aktivierung der Transkription des Zielgens ANGPTL4 durch verschiedene Stimuli auf dominante Weise unterdrückt. Die TGFβ-vermittelte Induktion der ANGPTL4-Transkription ist ein zentraler fördernder Schritt im Metastasierungsprozess von Brustkrebszellen. Aufgrund ihrer Eigenschaften, diese transkriptionelle Aktivierung von ANGPTL4 dominant zu unterbinden, sind inverse PPARβ/δ Agonisten vielsprechende Kandidaten in der Wirkstoffentwicklung zur Behandlung von Neoplasien. Der zugrundeliegende Mechanismus war weitgehend unverstanden, und Experimente unserer Arbeitsgruppe wiesen zunächst darauf hin, dass der dominant-repressive Effekt nicht durch NCoR/SMRT-Komplexe und die Deacetylase-Aktivität ihrer HDAC3-Untereinheit vermittelt wird. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Aufklärung des Mechanismus der transkriptionellen Repression durch inverse PPARβ/δ Agonisten. Dabei diente das besonders stark durch PPARβ/δ Liganden regulierte Zielgen ANGPTL4 als Modell-Locus. In ChIP-qPCR Experimenten konnte gezeigt werden, dass der inverse PPARβ/δ Agonist PT-S264 den Ablauf der Transkription von PPARβ/δ Zielgenen am Schritt der Initiation bzw. Reinitiation beeinträchtigt. Es wurde eine verminderte Rekrutierung aktivierender Untereinheiten des Mediator-Komplexes (MED1, MED26 und MED13L) sowie des generellen Transkriptionsfaktors (GTF) TFIIB und der RNA-Polymerase II zum ANGPTL4 Promotor festgestellt. Die Rekrutierung anderer GTFs wie TFIIA wird hingegen nicht beeinflusst. Aus der Literatur ist bekannt, dass der Mediator-Komplex die Rekrutierung von TFIIB unterstützt und dass sowohl der Mediator-Komplex als auch TFIIB für die Rekrutierung der RNA-Polymerase II zum Präinitiationskomplex erforderlich sind. Somit könnte letztlich die beeinträchtige Rekrutierung von aktivierenden Mediator-Untereinheiten (oder des gesamten Mediator-Komplexes) für die Beeinträchtigung der Rekrutierung von TFIIB und der RNA-Polymerase II ursächlich sein. Zur Identifikation von Co-Repressoren, die in Anwesenheit eines inversen Agonisten von PPARβ/δ rekrutiert werden, wurden ChIP-massenspektrometrische Analysen durchgeführt. Komponenten der NCoR/SMRT-Komplexe wurden als spezifische Interaktoren bei Bindung des inversen Agonisten PT-S264 detektiert. Unter den PT-S264 abhängigen Interaktoren fanden sich darüber hinaus keine anderen bekannten Co-Repressoren. Die verstärkte Rekrutierung von NCoR/SMRT-Komplexkomponenten durch PPARβ/δ bei Bindung des inversen Agonisten konnte in ChIP-qPCR Experimenten bestätigt werden. Um weitere Erkenntnisse über die transkriptionelle Regulation durch PPARβ/δ und insbesondere die Bindung der in Anwesenheit von PT-S264 rekrutierten Co-Repressoren zu gewinnen, wurde ein funktioneller Screen von 80 PPARβ/δ-Mutanten durchgeführt. MDA-MB-231-luc2 PPARD KO Zellen wurden retroviral mit mutierten PPARD cDNAs transduziert und auf eine Beeinträchtigung der transkriptionellen Regulation des Zielgens ANGPTL4 untersucht. Dabei wurden, neben der verstärkten Repression durch den inversen PPARβ/δ Agonisten PT-S264, auch die basale Repression und die Aktivierung durch den PPARβ/δ Agonisten L165,041 betrachtet. Mehrere in diesem funktionellen Screen identifizierte Mutanten zeigten einen Verlust der basalen Repression und waren von besonderem Wert für die weitere Untersuchung des Mechanismus der Repression durch inverse PPARβ/δ Agonisten. So zeigte sich im Basalzustand gegenüber den mit Wildtyp PPARβ/δ rekonstituierten Zellen eine verminderte Anwesenheit von NCoR/SMRT-Komplexkomponenten an PPREs von PPARβ/δ Zielgenen, die mit einer vermehrten Rekrutierung der RNA-Polymerase II an die Promotoren einherging. Durch den inversen Agonisten PT-S264 konnte die Rekrutierung von NCoR/SMRT-Komplexkomponenten und die daraus resultierende verminderte Rekrutierung der RNA-Polymerase II zum Promotor in den Mutanten wiederhergestellt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass sowohl die basale Repression als auch die Repression durch inverse PPARβ/δ Agonisten von NCoR/SMRT-Komplexen vermittelt werden. Die Rolle der enzymatischen Untereinheit der NCoR/SMRT-Komplexe HDAC3 bei der Repression wurde durch den Einsatz von Deacetylase-Inhibitoren überprüft. Dabei verhielten sich die basale Repression und die Repression durch den inversen Agonisten größtenteils insensitiv gegenüber der Inhibition von Deacteylase-Aktivität. Somit deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass NCoR/SMRT-Komplexe die transkriptionelle Repression durch inverse PPARβ/δ Agonisten über Deacetylase-abhängige und Deacetylase-unabhängige Mechanismen vermitteln. Die Unterdrückung der Rekrutierung von aktivierenden Mediator-Untereinheiten ist wahrscheinlich ursächlich für das Ausbleiben der Rekrutierung von TFIIB und der RNA-Polymerase II zum Transkriptionsstart. Somit wird letztlich die Transkription am Schritt der Initiation bzw. Reinitiation gestört. Abschließend wurden zwei Hypothesen aufgestellt, die interessante Fragestellungen für zukünftige Projekte aufwerfen: I. NCoR bzw. SMRT verhindern die Bildung eines aktiven Initiationskomplexes durch die direkte Inhibition von Acetyltransferase-Aktivität oder durch andere deacetylase-unabhängige Mechanismen. II. NCoR bzw. SMRT verhindern Kontakte zwischen regulatorischen Elementen und dem Promotor durch die Regulation von Chromatin-Interaktionen. Angesichts der Stabilisierung von Cohesin-Komplexen durch Acetylierungen könnte dies in direktem Zusammenhang mit Hypothese I stehen.

Summary:
The class II nuclear receptor peroxisome proliferator activated receptor β/δ (PPARβ/δ) binds with its obligate heterodimerization partner RXR to PPAR responsive elements (PPREs) of the DNA. In the unliganded state, PPARβ/δ exerts basal repression on the transcription of its canonical target genes by recruiting NCoR/SMRT complexes. Binding of an agonist leads to the dissociation of these co-repressors and allows for co-activator recruitment, which results in activation of transcription. On the other hand, synthetic inverse agonists provoke reinforced repression, which prevents transcriptional induction of the target gene ANGPTL4 by different stimuli in a dominant manner. TGFβ mediated induction of ANGPTL4 transcription is a central promoting step in metastasis of breast cancer cells. Based on their ability to suppress this transcriptional activation of ANGPTL4, PPARβ/δ inverse agonists are promising candidates for the development of antineoplastic agents. The underlying mechanism of repression was largely unknown, and experiments of our group initially indicated, that the dominant repressive effect is not mediated by NCoR/SMRT complexes and the deacetylase activity of its HDAC3 subunit. The present thesis addresses the elucidation of the mechanism of transcriptional repression by PPARβ/δ inverse agonists. ANGPTL4 regulation by PPARβ/δ ligands is particularly strong, and this gene was therefore used as model locus. ChIP-qPCR experiments showed that the PPARβ/δ inverse agonist PT-S264 impairs transcription at the initiation or reinitiation step, respectively. Diminished recruitment of activating subunits of the Mediator complex (MED1, MED26 and MED13L) as well as the general transcription factor (GTF) TFIIB and RNA polymerase II to the ANGPTL4 promotor was detected. In contrast, recruitment of other GTFs such as TFIIA was not affected. It is known from literature, that the Mediator complex supports recruitment of TFIIB and that both, Mediator and TFIIB, are necessary for the recruitment of RNA polymerase II to the preinitiation complex. Therefore, the impaired recruitment of activating Mediator subunits (or the entire Mediator complex) could be causative for the impairment of TFIIB and RNA polymerase II recruitment. To identify co-repressors, which are recruited to PPARβ/δ in the presence of inverse agonists, ChIP mass spectrometry analyses were perfomed. Components of NCoR/SMRT complexes were detected as specific interactors upon binding of PT-S264. Among the PT-S264 dependent interactors no other known co-repressors were identified. The increased recruitment of NCoR/ SMRT complex components by PPARβ/δ upon binding of the inverse agonist was validated in ChIP-qPCR experiments. To obtain further insights into transcriptional regulation by PPARβ/δ and particularly the binding of co-repressors recruited in the presence of PT-S264, a functional screen of 80 PPARβ/δ mutants was performed. MDA-MB-231-luc2 PPARD KO cells were retrovirally transduced with mutant PPARD cDNAs and tested for an impairment of transcriptional regulation of the target gene ANGPTL4. Besides reinforced repression by the PPARβ/δ inverse agonist PT-S264, basal repression in the absence of synthetic ligands and activation by the PPARβ/δ agonist L165,041 were analysed. Several mutants identified in the functional screen showed a loss of basal repression and were of value for further investigation of the mechanisms. Compared to cells transduced with wildtype PPARβ/δ, reduced presence of NCoR/SMRT complex components at the PPREs of PPARβ/δ target genes was detected in the basal state, which was accompanied by increased recruitment of RNA polymerase II at their promoters. In cells expressing the mutants, recruitment of NCoR/SMRT complex components and the resulting diminished recruitment of RNA polymerase II to the promoter was restored by the PPARβ/δ inverse agonist PT-S264. These findings suggest that both basal repression by unliganded PPARβ/δ and repression by the PPARβ/δ inverse agonist are mediated by NCoR/SMRT complexes. The role of the HDAC3 subunit of NCoR/SMRT complexes in repression was tested by the use of deacetylase inhibitors. Basal repression as well as repression by the inverse agonist were largely insensitive to inhibition of deacetylase activity. Taken together, the results of the present thesis indicate that NCoR/SMRT complexes mediate the transcriptional repression by PPARβ/δ inverse agonists by both deacetylase-dependent and deacetylase-independent mechanisms. Prevention of recruitment of activating Mediator sub-units is probably causative for diminished TFIIB and RNA polymerase II recruitment to the transcription start site. Consequently, transcription is impaired at the initiation or reinitiation step. In conclusion, two hypotheses were proposed, which raise interesting questions for future approaches: I. NCoR and/ or SMRT prevent the formation of an active initiation complex by direct inhibition of acetyltransferase activity or through other mechanisms which do not rely on deacetylase activity. II. NCoR and/ or SMRT prevent contacts between regulatory elements and the promotor by regulating chromatin interactions. Given the stabilization of cohesin complexes by acetylation, this could be directly linked to hypothesis I.


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