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Titel:Unterschiedliche Sensitivität von Kopf-Halskarzinom Zelllinien auf den EMT Masterregulator TGF-β1
Autor:Reinhardt, Laura
Weitere Beteiligte: Mandic, Robert (apl. Prof. Dr. med.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0408
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0408
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-04081
DDC:610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Differential response of head and neck squamous cell carcinoma cell lines to the EMT master regulator TGF-β1

Dokument

Schlagwörter:
HNO, EMT, TGF-β1, HNSCC

Zusammenfassung:
Plattenepithelkarzinome im Kopf- und Halsbereich (HNSCC) gehören zu den sechsthäufigsten Tumoren weltweit. Trotz verbesserter Behandlungsmethoden liegt die 5-Jahres-Überlebensrate bei lediglich 50%. Prognose entscheidend für HNSCC Patienten ist die zum Zeitpunkt der Diagnose häufig bereits stattgefundene Metastasierung. Ein zentraler Mechanismus, der dem invasiven Potential von HNSCC und anderen Tumoren zugrunde liegt, ermöglicht es Tumorzellen aus einer stationären, epithelialen Form in eine motile Form, welche Eigenschaften mesenchymaler Zellen aufweist, überzugehen. Diese sogenannte Epitheliale Mesenchymale Transition (EMT), ist mit der verringerten Expression typischer epithelialer Markerproteine wie E Cadherin und Keratinen sowie der Zunahme typischer mesenchymaler Faktoren wie N Cadherin und Vimentin assoziiert. Als ein zentraler Regulator der EMT wurde Transforming Growth Factor (TGF)-β1 identifiziert. Unter dem Einfluss von TGF-β1 entwickeln Kopf-Halstumorzellen einen mesenchymalen Phänotyp, welcher assoziiert ist mit einer gesteigerten Migration und klinisch schlechterer Prognose. TGF-β1 kann je nach zellulärem Kontext sowohl als Tumorsuppressor als auch Tumorpromoter wirken. TGF-β1, aktiviert über seinen Rezeptor TGF-β RII neben dem Smad abhängigen Signalweg, weitere Smad unabhängige Signalwege, wie Erk/MEK, PI3K/MAPK und Ras. Dies führt zur Modulation der E-Cadherin Expression, zur Bildung von β-Aktin Stressfasern über Modulierung des Zytoskeletts und zu einer erhöhten Migration und Invasivität der Zellen. In HNSCC Tumoren, die sich in ihrem Invasivitätspotential und ihrer Differenzierung häufig sehr heterogen darstellen, konnten durch zahlreiche Untersuchungen Hinweise eines relevanten Einflusses der EMT auf diesen Phänotyp gefunden werden. Es stellt sich dabei die Frage, ob das histopathologisch zu beobachtende variierende Differenzierungs- bzw. Invasivitätsmuster auf eine unterschiedliche Aktivierung von EMT induzierenden Faktoren zurückgeführt werden kann. Zur Untersuchung wie sich verschiedene etablierte HNSCC Zelllinien in vitro in ihrer Sensitivität auf EMT induzierende Zytokine unterscheiden, wurden Zelllinien eingesetzt, die Unterschiede in relevanten EMT Merkmalen aufweisen. Beurteilt wurde der morphologische Phänotyp der Zellen ohne und nach Zugabe EMT induzierender Faktoren, die Aktivierung (Phosphorylierung) des TGF-β Rezeptors Typ II, sowie Änderungen im Migrationsverhalten, E Cadherin Status und in der Zytoskelettarchitektur. Das Ausmaß der EMT Antwort von HNSCC-Zelllinien auf exogen zugeführtes TGF-β1 zeigte signifikante Unterschiede in der Sensitivität, welche mit dem initialen Phänotyp unbehandelter HNSCC Zellen korrelierte. Bei Zugabe von TGF-β1 glich sich der Phänotyp bei den verschiedenen Zelllinien in Richtung mesenchymal an, da eher epitheliale Zelllinien besonders sensitiv reagierten und die Sensitivität auf exogenes TGF-β1 bei Zelllinien mit bereits vorhandener mesenchymaler Ausprägung weniger deutlich erfolgte. Die Transformation des Zellphänotyps durch TGF-β1 konnte anhand mikroskopischer Aufnahmen, einer Veränderung der in vitro Proliferation der Zelllinien, einer Aktivierung des TGF-β RII sowie durch subzelluläre Umverteilung von EMT typischen Proteinen und Strukturen des Zytoskeletts nachgewiesen werden. An der morphologischen Änderung war insbesondere eine Modulierung des Aktinzytokskeletts, sowie die E-Cadherin Relokalisation bzw. der E-Cadherin Abbau beteiligt. Da TGF-β1 und andere Zytokine durch Zellen des Stromas (z.B. Immunzellen) sezerniert werden, könnte die Tumormikroumgebung (tumor microenvironment) mit verantwortlich sein für den in HNSCC Tumoren beobachteten variablen zellulären Phänotyp, welcher mit der Fähigkeit der Tumorzellen zur Invasivität und Metastasierung korreliert. Im Hinblick auf die vorliegenden Untersuchungen stellt sich dabei die Frage, inwiefern eine autokrine Sekretion von TGF-β1 (bzw. andere EMT Zytokine) in HNSCC Tumorzellen zu den beobachteten Sensitivitätsunterschieden einer EMT beigetragen hat. Für weiterführende Untersuchungen erscheint es daher sinnvoll nach Identifikation von Zelllinien-spezifischen EMT Zytokinen sowie anderen relevanten Komponenten der EMT diese gezielt auszuschalten, um hierdurch neue therapeutische Angriffsziele zur Hemmung der Invasivität und Metastasierung von HNSCC Tumoren aufzudecken.

Summary:
Head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) are the sixth most common tumors world wide. Despite improved treatments the 5-year survival rate has remained merely at 50%. Crucial for prognosis of HNSCC patients is the level of metastatic spread that has often already occurred at the time of diagnosis. A central mechanism underlying the invasive potential of HNSCC allows to transform tumor cells from a stationary, epithelial-like into a motile form thereby aquiring mesenchymal cell properties. This so-called epithelial mesenchymal transition (EMT) is characterized by the reduced expression of typical epithelial marker proteins such as E-cadherin and keratins as well as an increase in typical mesenchymal factors such as N-cadherin and vimentin. Transforming growth factor (TGF)-β1 was identified as a central regulator of EMT. Head and neck tumor cells, under the influence of TGF-β1, develop a mesenchymal phenotype associated with increased migration and clinically poor prognosis. TGF-β1 may act as a tumor suppressor as well as a tumor promoter, depending on the cellular context. TGF-β1, via its receptor TGF-β RII, activates -besides the Smad-dependent signaling pathway- other Smad-independent signaling pathways, such as Erk/MEK, PI3K/MAPK and Ras. This results in the modulation of E-cadherin expression, formation of actin stress fibers via modulation of the cytoskeleton, and increased tumor cell migration and invasion. Numerous studies have found evidence of a relevant role of EMT in HNSCC, being involved in the observed different morphological HNSCC phenotypes. This raises the question of whether the observed varying histopathological pattern of differentiation or invasiveness can be attributed to a difference in the activation status of EMT inducing factors. HNSCC cell lines with differences in their epithelial/mesenchymal phenotypes were used to investigate how they differ in their sensitivity to EMT-inducing cytokines in vitro. The morphological phenotype without and with the exogenous supply of EMT inducing factors, the activation (phosphorylation) of the TGF-β receptor type II as well as changes in the migration behavior, E-cadherin status and cytoskeleton architecture were assessed. Upon addition of TGF-β1, the rather epithelial cell lines adapted a more mesenchymal phenotype, whereas in cells that already carried mesenchymal features, this effect was less pronounced. Transformation of the cellular phenotype by TGF-β1 was documented by microscopic imaging, alteration of in vitro proliferation, activation of the TGF-β RII, and subcellular redistribution of typical EMT proteins as well as in changes of the cytoskeleton architecture. In particular, a modulation of the actin cytoskeleton, as well as the E-cadherin relocalization and E-cadherin degradation appeared to be involved in the morphological change. Since TGF-β1 and other cytokines are partially secreted by cells of the stroma (e.g. immune cells), the tumor microenvironment may be involved in the variable cellular phenotypes observed in HNSCC tumors, which correlate with the ability of the tumor cells to invade and metastasize. In view of the present investigations, the question arises to which extent an autocrine secretion of TGF-β1 (or other EMT cytokines) in HNSCC tumor cells contributed to the observed variable sensitivity of the cells to exogenous TGF-β1. For further investigations, it seems meaningful to, after evaluation of the cell-line-specific TGF-β1 expression (including other EMT cytokines) or other relevant components of the EMT, to specifically knockdown these components as this may potentially lead to new therapeutic targets that can be used to inhibit invasiveness and metastasis of HNSCC tumors.


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