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Titel:Synthetic lethal interactions between ATR and DNA polymerases as a novel concept for individualized cancer therapy
Autor:Job, Albert
Weitere Beteiligte: Gallmeier, Eike (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0383
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-03830
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0383
DDC:610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Synthetisch letale Interaktionen zwischen ATR und DNA-Polymerasen als neuartiges Konzept für die individualisierte Tumortherapie

Dokument

Schlagwörter:
cancer therapy, ATR, synthetic lethality, ATR, DNA polymerases, PRIM1, DNA-Polymerasen, Tumortherapie, POLD1, PRIM1, POLD1, synthetische Letalität

Summary:
The chemical inhibition of the kinase ATR, a central regulator of the DNA damage response, eliminates subsets of cancer cells in different tumors. This effect is at least partly attributable to the synthetic lethal relationship between ATR and certain DNA repair genes. In a previous study of our laboratory, POLD1 and PRIM1 were identified to act synthetically lethal with ATR. Thus, this dissertation was divided into two subprojects to characterize the synthetic lethal relationship between ATR and each of the two identified proteins individually. The first subproject addressed the characterization of the synthetic lethal relationship between ATR and PRIM1, the catalytic subunit of primase of the polymerase α-primase complex. Applying a genetic ATR knock-in model of colorectal cancer cells, we confirmed that siRNA-mediated PRIM1 depletion inhibits proliferation of ATR-deficient cells, and excluded both off-target effects of the applied siRNA targeting PRIM1, and artifacts due to clonal variation by using an ATR re-expressing cell clone. We expanded these data by demonstrating in a panel of different cancer cell lines that not only genetically induced ATR deficiency but also chemical inhibition of ATR or its main effector kinase CHK1 inhibits proliferation upon PRIM1 depletion. Mechanistically, PRIM1 depletion in ATR-deficient cells caused S-phase stasis with no evidence for increased DNA damage followed by Wee1-mediated activation of caspase 8 and consequently of apoptosis. As PRIM1 inactivation sensitizes cancer cells to ATR and CHK1 inhibitors, alterations in PRIM1 or other components of the polymerase α-primase complex could represent a novel concept for the individualized cancer therapy using ATR pathway inhibitors. The second subproject addressed the further characterization of the synthetic lethal relationship between ATR and POLD1, the catalytic subunit of polymerase δ. In the previous study of our laboratory, we demonstrated that not only genetically induced ATR deficiency but also chemical inhibition of the ATR pathway inhibits proliferation upon POLD1 depletion. To extend these data, we now characterized the impact of defined POLD1 variants on the sensitivity to ATR pathway inhibitors. Therefore, we used the CRISPR/Cas9 technique in the colorectal cancer cell line DLD-1, which harbors four heterozygous POLD1 variants, to establish heterozygous POLD1-knockout clones with exclusive expression of distinct POLD1 variants. These knockout clones served as a model to determine the functional significance of individual POLD1 variants. We demonstrated that of the four variants analyzed onlyPOLD1R689W impairs POLD1 function, as shown by compensatory ATR pathway activation and impaired DNA replication. Moreover, the POLD1-R689W variant in cancer cells led to a strong decrease of cell survival in vitro and decelerated growth of murine xenograft tumors in vivo upon treatment with ATR pathway inhibitors, which further corroborates a potential clinical relevance of our data. Our here established and characterized functional model could thus be used to complement algorithm-based models to predict the pathogenicity of tumor-specific variants of uncertain significance, and improve their accuracy. Furthermore, our data enable a novel and potentially clinically relevant concept for the individualized and genotype-based therapy of POLD1-deficient cancers with ATR pathway inhibitors. Taken together with the in the literature identified variants of uncertain significance of POLD1 and POLE as well as defects in other polymerases in cancer the data of this dissertation illustrate the emerging role of tumor-specific alterations in DNA polymerases as novel therapeutic targets. The comprehensive identification and functional characterization of all polymerases and their possible synthetic lethal partners is thus essential in future studies.

Zusammenfassung:
Die chemische Inhibition der Kinase ATR, einem zentralen Regulator der DNA damage response, eliminiert Subpopulationen von Krebszellen in verschiedenen Tumoren. Dieser Effekt ist zumindest teilweise der synthetisch letalen Beziehung zwischen ATR und bestimmten DNA-Reparaturgenen zuzuschreiben. Eine frühere Studie unseres Labors identifizierte POLD1 und PRIM1 als synthetisch letale Partner von ATR. Diese Dissertation wurde daher in zwei Teilprojekte untergliedert, um die synthetisch letalen Beziehungen zwischen beiden Partnern mit ATR zu charakterisieren. Das erste Teilprojekt befasste sich mit der Charakterisierung der synthetisch letalen Beziehung zwischen ATR und PRIM1, der katalytischen Untereinheit der Primase des Polymerase α/Primase-Komplexes. Durch die Verwendung eines genetischen ATR-knock-in-Modells in kolorektalen Karzinomzellen bestätigten wir, dass die siRNA-vermittelte PRIM1-Depletion die Proliferation ATR-defizienter Zellen inhibiert und schlossen sowohl off-target-Effekte der verwendeten siRNA gegen PRIM1 als auch klonale Artefakte durch die Verwendung eines ATR-reexprimierenden Zellklons aus. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass in einer Reihe verschiedener Krebszelllinien nicht nur die genetisch induzierte ATR-Defizienz, sondern auch die chemische Inhibition von ATR oder dessen Haupteffektorkinase CHK1 die Proliferation nach PRIM1-Depletion inhibiert. Mechanistisch verursachte die PRIM1-Depletion in ATR-defizienten Zellen eine Stagnation während der S-Phase ohne Hinweis auf eine erhöhte DNA-Schädigung, gefolgt von einer Wee1-vermittelten Aktivierung von Caspase 8 mit anschließender Apoptose. Da also die PRIM1-Inaktivierung Krebszellen auf ATR- und CHK1-Inhibitoren sensitiviert, könnten Defekte in PRIM1 oder anderen Komponenten des Polymerase α/Primase-Komplexes ein neuartiges Konzept für die individualisierte Tumortherapie mittels Inhibitoren des ATR-Signalweges darstellen. Das zweite Teilprojekt befasste sich mit der tiefer gehenden Charakterisierung der synthetisch letalen Beziehung zwischen ATR und POLD1, der katalytischen Untereinheit der Polymerase δ. So konnte bereits die vorangegangene Studie aus unserem Labor zeigen, dass sowohl die genetisch induzierte ATR-Defizienz als auch die chemische Inhibition des ATR-Signalweges die Proliferation nach POLD1-Depletion inhibiert. Um diese Daten zu erweitern, charakterisierten wir nun den Einfluss von bestimmten POLD1-Varianten auf die Sensitivität gegenüber ATR-Signalweginhibitoren. Dazu verwendeten wir in der kolorektalen Karzinomzelllinie DLD-1, die vier heterozygote POLD1-Varianten enthält, die CRISPR/Cas9-Methode, um heterozygote POLD1-knockout-Klone mit ausschließlicher Expression einzelner POLD1-Varianten zu etablieren. Diese knockout-Klone dienten als Modell, um die funktionelle Bedeutung individueller POLD1-Varianten zu bestimmen. Anhand einer kompensatorischen ATR-Signalwegaktivierung und einer beeinträchtigten DNA-Replikation konnten wir zeigen, dass von den vier untersuchten Varianten nur POLD1-R689W die POLD1-Funktion schädigte. Weiterhin verursachte die POLD1-R689W-Variante in Krebszellen eine starke Beeinträchtigung des Zellüberlebens in vitro und eine Verlangsamung des Wachstums muriner Xenografttumore in vivo nach Behandlung mit verschiedenen Inhibitoren des ATR-Signalweges. Dies untermauert zusätzlich die potentiell klinische Relevanz unserer Daten. Unser hier etabliertes und charakterisiertes funktionelles Modell könnte daher verwendet werden, um algorithmus-basierte Modelle, mit der die Pathogenität tumorspezifischer Varianten unklarer Signifikanz vorhergesagt wird, zu komplementieren und deren Genauigkeit zu verbessern. Weiterhin ermöglichen unsere Daten ein neues und potentiell klinisch relevantes Konzept für die individualisierte und Genotyp-basierte Therapie POLD1-defizienter Tumore mit ATR-Signalweginhibitoren. Zusammen mit den in der Literatur identifiziertenVarianten unklarer Signifikanz in POLD1 und POLE sowie den Defekten anderer Polymerasen in Tumoren verdeutlichen die Daten dieser Dissertation die zunehmende Bedeutung tumorspezifischer Veränderungen in DNA-Polymerasen als neue therapeutische Zielstrukturen. Daher ist eine umfassende Identifizierung und funktionelle Charakterisierung aller Polymerasen und ihrer möglichen synthetisch letalen Partner in zukünftigen Studien erforderlich.


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