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Titel:Development and validation of serological immunoassays in laminin γ-1 pemphigoid and epidermolysis bullosa acquisita
Autor:Solimani, Farzan
Weitere Beteiligte: Hertl, Michael (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0331
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-03314
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0331
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Etablierung und Validierung serologischen Immunoassays beim laminin γ-1 pemphigoid und epidermolysis bullosa acquisita

Dokument

Schlagwörter:
epidermolysis bullosa acquisita, laminin γ-1 pemphigoid, autoimmunity, laminin γ-1 pemphigoid, epidermolysis bullosa acquisita, blistering skin diseases, Bullöse autoimmune Hauterkrankungen, Autoimmunität, Serologie, autoantibodies, Autoantikörper

Summary:
Pemphigoid diseases encompass a heterogeneous group of subepidermal autoimmune bullous diseases of the skin and mucosa. These disorders are characterized by autoantibodies that target distinct structural proteins of the basement membrane zone which are crucial for the integrity of the skin. Targeting of these proteins leads to skin fragility, detachment of the epidermis and eventually formation of blisters and skin inflammation. The clinical presentation of the pemphigoids is heterogeneous, the subtypes are divided by clinical symptoms, target antigens and response to treatment. A crucial step for the proper classification is the serological detection of the autoantigens directed against distinct components of the dermal epidermal junction. Thus, it is crucial to develop reliable and reproducible diagnostic methods which help clinicians to differentiate between different entities and therefore to select the best treatment. This thesis is focused on Laminin γ-1 pemphigoid and epidermolysis bullosa acquisita, the study of their clinical appearance and the development and validation of serological assays to correctly diagnose these two entities. Both autoimmune blistering diseases are rare and often hard to diagnose with standard serological assays. In the first study presented in this thesis, I discuss the development of an immunoblot assay for the detection of autoantibodies against Laminin γ-1. Laminin γ-1 pemphigoid is a novel subepidermal blistering disease which has been first described in 1996. Since then, different immune serological methods for the detection of circulating autoantibodies have been described, however these are often not reproducible for most of the centers worldwide, since often advanced lab skills are required. In our study, we present a novel immunoblot assay based on three commercially available Laminin γ-1 recombinants, which can be reproduced in almost every laboratory with basic skills. In the second study, we thought to serologically identify for the best immunoassay for the detection of serum IgG autoantibodies against anti-human collagen VII in patients with epidermolysis bullosa acquisita. Epidermolysis bullosa acquisita is a severe blistering diseases characterized by circulating IgG autoantibodies targeting human collagen VII. In this study, four different diagnostic assays (immunoblot, indirect immunofluorescence with saline split human skin and 2 enzyme linked immunosorbent assays) have been tested and compared with regard to their sensitivity and specificity in a large cohort of epidermolysis bullosa acquisita sera (n=95). In summary, our study showed that enzyme linked immunosorbent assays based on recombinant human collagen VII NC1-NC2 or collagen VII-NC1 proteins provide the highest sensitivity and specificity for the detection of anticollagen VII IgG and should be preferred to immunoblot analysis or indirect immunofluorescence on saline split human skin in making the diagnosis of epidermolysis bullosa acquisita.

Zusammenfassung:
Die Pemphigoide umfassen eine heterogene Gruppe von subepidermalen autoimmunbullösen Erkrankungen der Haut und der Schleimhaut. Diese Erkrankungen sind durch Autoantikörper gekennzeichnet, die auf bestimmte Strukturproteine der Basalmembranzone abzielen, die für die Integrität der Haut entscheidend sind. Ein gezieltes Anzielen dieser Proteine führt zu Brüchigkeit der Haut, Ablösung der Epidermis und schließlich zur Bildung von Blasen und Hautentzündungen. Das klinische Erscheinungsbild der Pemphigoide ist heterogen, die Subtypen sind nach klinischen Symptomen, Zielantigenen und Ansprechen auf die Behandlung unterteilt. Ein entscheidender Schritt für die korrekte Klassifizierung ist der serologische Nachweis von Autoantikörpern gegen bestimmte Komponenten der dermal- epidermalen Junktionszone. Daher ist es wichtig, zuverlässige und reproduzierbare Diagnoseverfahren zu entwickeln, die den Ärzten dabei helfen, zwischen verschiedenen Entitäten zu unterscheiden und somit die beste Behandlung auszuwählen. Diese Dissertation konzentriert sich auf Laminin-γ-1-Pemphigoid und Epidermolysis bullosa acquisita, die Untersuchung ihres klinischen Erscheinungsbildes und die Entwicklung und Validierung serologischer Tests zur korrekten Diagnose dieser beiden Entitäten. Beide Autoimmunkrankheiten sind selten und mit serologischen Standardassays oft schwer zu diagnostizieren. In der ersten Studie, die in dieser Dissertation vorgestellt wurde, diskutiere ich die Entwicklung eines Immunoblot-Assays zum Nachweis von Autoantikörpern gegen Laminin γ-1. Laminin-γ-1-Pemphigoid ist eine neue blasenbildende Erkrankung der Pemphigoidgruppe, die erstmals 1996 beschrieben wurde. Seitdem wurden verschiedene Methoden zum Nachweis zirkulierender Autoantikörper nachgewiesen, die jedoch für die meisten Zentren weltweit häufig nicht reproduzierbar sind, da fortgeschrittene Labortechniken erforderlich sind. In unserer Studie stellen wir einen neuartigen Immunoblot-Assay vor, der auf kommerziell erhältlichen rekombinanten Proteinen des Laminin γ-1 basiert und in fast jedem Labor mit grundlegenden Kenntnissen reproduziert werden kann. In der zweiten Studie untersuchen wir, den besten Immunoassay zum Nachweis von Autoantikörpern gegen Anti-Human-Kollagen VII bei Patienten mit Epidermolysis bullosa acquisita serologisch zu identifizieren. Epidermolysis bullosa acquisita ist eine schwere blasenbildende Autoimmunerkrankung, die durch zirkulierende IgG-Autoantikörper gegen humanes´Kollagen VII gekennzeichnet ist. In dieser Arbeit wurden vier verschiedene diagnostische Assays (Immnoblot, indirekte Immunfluoreszenz mit menschlicher Kochsalz-Spalthaut und zwei ELISA) getestet und hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität in einer großen Kohorte von Epidermolysis bullosa acquisita-Seren verglichen (n = 95). Zusammenfassend hat unsere Studie gezeigt, dass ein ELISA, der auf rekombinanter humaner Kollagen-VII-NC1-NC2-Domäne oder Kollagen-VII-NC1-Domäne basiert, die höchste Empfindlichkeit und Spezifität für den Nachweis von Anti-Kollagen-VII IgGAntikörper bietet.


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