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Titel:Einfluss von PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide) beziehungsweise des PACAP-Rezeptors PAC1 auf die Morphologie der Nierenrinde bei cholesterin- und normalgefütterten ApoE-/- Mäusen
Autor:Blähser, Teresa
Weitere Beteiligte: Kinscherf, Ralf (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0324
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0324
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-03246
DDC:610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):The influence of PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide) respectively of the PACAP-receptor PAC1 on the morphology of the cortex of kidney in ApoE-/-mice fed with cholesterol-enriched diet or standard diet

Dokument

Schlagwörter:
PACAP, Cholesterin, Western-type Diet, PAC1, CED, ApoE, Niere, kidney, ApoE, nephron, Glomerulus, Glomerulus, PAC1, Niere, PACAP, PACAP

Zusammenfassung:
Hintergrund: Krankheiten des Herz-Kreislaufsystems waren im Jahr 2015 mit 39% die häufigste Todesursache in Deutschland und sind weltweit ein großes gesundheitliches Problem. Die Atherosklerose nimmt in diesen Pathologien einen nicht zu vernachlässigenden Stellenwert ein. Im entzündlichen Entstehungsprozess der chronischen Gefäßerkrankung spielen Lipidstoffwechsel und Makrophagen eine wichtige Rolle. Das ApoE-/- Mausmodell ist etabliert, um Atherosklerose und dessen Einflussfaktoren sowie Nierenerkrankungen zu untersuchen. Das Peptid PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Protein) gehört zur Glucagon-PACAP-VIP Protein-Superfamilie. Es wirkt antiinflammatorisch, antiapoptotisch und antioxidativ und zeigt diese Eigenschaften auch in der Niere in einem nephroprotektiven Effekt. In dieser Studie wurde erstmals untersucht, inwieweit die Defizienz von PACAP bzw. dessen Rezeptor PAC1 im ApoE-/- Mausmodell inflammatorische Reaktionen und morphologische Veränderungen der Niere hervorrufen und/oder beeinflussen. Zusätzlich wurde der Einfluss der Verabreichung eines cholesterinangereicherten Futters auf diese Parameter untersucht. Material und Methoden: Für die Untersuchung standen folgende Maus-Genotypen zur Verfügung: WT, ApoE-/-, PACAP-/-/ApoE-/- bzw. PAC1-/-/ApoE-/-. Den jeweils zehn Wochen alten Mäusen wurde für 20 Wochen entweder Normalfutter (NF) oder cholesterinangereicherte Nahrung (CED) verabreicht. Es ergaben sich insgesamt sieben Mausgruppen, vom WT gab es nur eine CED Gruppe. Körpergewicht und Plasma-Cholesterin- sowie Triglyceridspiegel wurden gemessen. Nach Tötung der Tiere erfolgte die Organentnahme. Die Nieren wurden kryofixiert. 6μm dünne Kryoschnitte der Niere wurden in einer Azan- und ORO-Färbung histologisch, histomorphometrisch und immunhistologisch mittels der Antikörper MOMA-2 (Monozyten und Makrophagen), F4/80 (vorwiegend residente Makrophagen), TNFα und IL-6 (proinflammatorische Zytokine) gefärbt und analysiert. Anhand der Azanfärbung wurden die Nierenschnitte bezüglich Anzahl, Durchmesser und Fläche der Glomeruli sowie ihres Bindegewebsanteils untersucht und vermessen. Ergebnisse: Die verabreichte CED führte innerhalb der PACAP-/-/ApoE-/- Mäuse zu signifikant schwereren Tieren als unter NF. Die PACAP-/-/ApoE-/- Mäuse waren nach CED signifikant schwerer als die ApoE-/- Mäuse (Kontrolle). Die PACAP-/-/ApoE-/- Mäuse waren unter NF jedoch leichter als die ApoE-/- Mäuse. Hier besteht eine Wechselwirkung zwischen Gewicht und Genotyp. Die Plasma-Cholesterinspiegel waren nach CED bei ApoE-/-, PACAP-/-/ApoE-/- und PAC1-/-/ApoE-/- Mäusen signifikant höher als nach NF. Nach CED waren die Plasma-Triglyceridspiegel der PACAP-/-/ApoE-/- Mäuse signifikant höher als die der ApoE-/- Mäuse. Bei der morphologischen Untersuchung ergab sich nach CED eine signifikant erhöhte Anzahl an Nierenkörperchen bei den PACAP-/-/ApoE-/- Mäusen im Vergleich zu den ApoE-/- Mäusen. Die Fläche der Nierenkörperchen war im Vergleich zu den ApoE-/- Mäusen nach CED bei den PAC1-/-/ApoE-/- Mäusen signifikant um 22%, bei den WT Mäusen um 21% niedriger. Auch bzgl. des Durchmessers der Nierenkörperchen waren diejenigen der PAC1-/-/ApoE-/- Mäuse bei NF und CED kleiner als bei den ApoE-/- Mäusen. Bezüglich des renalen Bindegewebsanteils bzw. einer möglichen Fibrosierung konnten wir keine signifikanten Unterschiede zwischen Futtergruppen und Genotypen nachweisen. Die ApoE-/- Mäuse zeigten nach CED eine doppelt so hohe Dichte an MOMA-2+ Zellen im Nierenkortex wie die WT Mäuse. Die PAC1-/-/ApoE-/- Mäuse zeigten nach CED eine viermal geringere Dichte an F4/80+ Zellen im Nierenkortex als die ApoE-/- Mäuse (Kontrolle). Innerhalb der ApoE-/- Mäuse bewirkte die CED eine um 2,5fach höhere Dichte an F4/80+ Zellen als bei Verabreichung von NF. Der Futterunterschied wirkte sich auch auf die Dichte der IL-6+ Zellen im Nierenkortex aus: Nach CED zeigten PACAP-/-/ApoE-/- Mäuse glomerulär und tubulär eine höhere Dichte an IL-6+ Zellen als nach NF. Bei den ApoE-/- Mäusen war die Dichte an IL-6+ Zellen im Tubulussystem nach CED höher als nach NF. Die ApoE-/- Mäuse zeigten im Tubulussystem nach NF eine höhere Dichte an TNFα+ Zellen als nach CED. Nach NF war in den Tubuli von PACAP-/-/ApoE-/- Mäusen die Dichte an TNFα+ Zellen signifikant geringer als bei den ApoE-/- Mäusen. Schlussfolgerung: Abschließend lässt sich sagen, dass bei den PAC1-/-/ApoE-/- Mäusen nach CED kleinere Glomeruli und eine geringere Dichte residenter Makrophagen als bei ApoE-/- Mäusen (Kontrolle) gefunden wurden. Die CED bewirkte eine signifikant höhere Dichte an IL-6+ Zellen in Glomeruli und Tubuli der PACAP-/-/ApoE-/- Mäuse im Vergleich zu NF.

Summary:
Background: Cardiovascular diseases were with 39% the leading cause of death in Germany in 2015 and a worldwide severe health problem. Atherosclerosis has an enormous significant value in that kind of pathologies. In the inflammatory etiology of this chronic vascular disease, lipid metabolism and macrophages play a key role. The ApoE-/- mouse model is a well-established model of atherosclerosis. PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Peptide) is part of the glucagon-PACAP-VIP protein-superfamily. It acts antinflammatory, antiapoptotic and antioxidative has nephroprotective effects. In this study the effect of the deficiency of PACAP and its receptor PAC1 is investigated on inflammatory and morphological changes of the murine kidney of ApoE-/- mice. Additionally, the impact of cholesterol-enriched diet (CED) on these parameters was examined. Methods and Materials: The following four genotypes of mice were reviewed: WT, ApoE-/-, PACAP-/-/ApoE-/- and PAC1-/-/ApoE-/-. The ten-week-old knockout-mice were fed for 20 weeks either a standard diet (SD) or a cholesterol-enriched diet (CED). Of WT mice we reviewed only a CED-fed group, so there are seven groups of mice in total. Body weight, plasma-cholesterol and -triglycerides were measured. After euthanizing, organs were collected and shockfrozen in liquid nitrogen-cooled isopentane. Kidney cryo-sections (6μm) were analyzed by using Azan-, ORO-staining and the antibodies MOMA-2 (monocytes and macrophages), F4/80 (resident macrophages), IL-6 and TNFα (proinflammatory cytokines). Based on Azan-staining the number, area and diameter of the glomeruli were measured as well as the relative percentage of connective tissue in the kidney sections to analyze possibly existing fibrosis. Results: Application of the CED resulted in significant heavier PACAP-/-/ApoE-/- mice compared to SD. PACAP-/-/ApoE-/- mice fed with CED were heavier than ApoE-/- mice (control). After SD, PACAP-/-/ApoE-/- mice were not so heavy as ApoE-/- mice. Relating to the bodyweight, there was an interaction between genotype and nutrition. After application of the CED, plasma cholesterol levels were higher in ApoE-/-, PACAP-/-/ApoE-/- and PAC1-/-/ApoE-/- compared to SD and plasma triglyceride levels of PACAP-/-/ApoE-/- mice were significantly higher than in ApoE-/- mice. After quantification of morphology in PACAP-/-/ApoE-/- mice after CED the number of glomeruli was increased in comparison with ApoE-/- mice. After application of CED, in kidneys of PAC1-/-/ApoE-/- and WT mice the glomerular area was smaller about 22% and 21% in comparison to ApoE-/- mice. After both, SD or CED, in kidneys of PAC1-/-/ApoE-/- mice the glomeruli were smaller related to diameter than in ApoE-/- mice. Regarding the relative percentage of connective tissue and hence a possible renal fibrosis/sclerosis in the kidneys, we could not show any difference between the types of nutrition or genotypes. After application of CED, ApoE-/- mice showed a twofold higher density of MOMA-2+ macrophages in the renal cortex than WT. PAC1-/-/ApoE-/- mice showed four times less density of F4/80+ macrophages in renal cortex than ApoE-/- mice (control). In ApoE-/- mice, application of CED resulted in a 2,5-fold higher density of F4/80+ macrophages than SD. The type of nutrition influenced the density of IL-6+ cells in renal cortex: After CED, PACAP-/-/ApoE-/- mice showed a higher density of IL-6+ cells in glomeruli and tubuli than after SD. After CED, in tubuli of ApoE-/- mice density of IL-6+ cells was higher than after SD. After CED, in tubuli of ApoE-/- mice density of TNFα+ cells was less than after SD. After application of SD, in the tubular cells of PACAP-/-/ApoE-/- mice the density of TNFα+ cells was less than in ApoE-/- mice. Conclusion: Summed up, PAC1-/-/ApoE-/- mice fed a CED show smaller glomeruli and a reduced density of resident macrophages (F4/80) than ApoE-/- mice (control) in renal cortex. After CED, PACAP-/-/ApoE-/- mice showed significant higher density of IL-6+ cells in glomerular and tubular cells than after SD.


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