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Titel:Untersuchung zum Einfluss verschiedener Bisphosphonate auf Zellviabilität und Migrationsfähigkeit von Osteoblastem, Fibroblasten, HUVEC und EPC sowie ihrer Beeinflussung durch Geranyl-Geraniol Substitution
Autor:Lux,Christine
Weitere Beteiligte: Ziebart, Thomas (PD Dr. Dr. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0301
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0301
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-03019
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Investigation of the influence of different bisphosphonates on the cell viability and migration capacity of osteoblasts, fibroblasts, HUVEC and EPC as well as their influence by geranylgeraniol substitution

Dokument

Schlagwörter:
Zellviabilität, Geranyl Geraniol, Bisphosphonate, Migrationsfähigkeit

Zusammenfassung:
Die Medikamentengruppe der Bisphosphonate gehört zu den osteoanabolen Stoffen, die bei einer Vielzahl von Krankheiten des Knochengewebes eingesetzt werden. Wesentliche Indikationen sind Osteoporose, Morbus Paget sowie onkologische Krankheitsbilder wie das Multiple Myelom oder ossäre Metastasen. Eine Nebenwirkung ist die Entstehung von Kiefernekrosen unter Bisphosphonattherapie. Die Bisphosphonat assoziierte Kiefernekrose kennzeichnet sich durch einen freiliegenden nekrotischen Kieferknochen und stellt eine wesentliche Beeinträchtigung der oralen Gesundheit der betroffenen Patienten dar. Die Pathogenese der Bisphosphonat assoziierten Kiefernekrose ist derzeit nicht vollständig geklärt, wird aber als multifaktorieller Genese angesehen. Neben dem Haupteffekt auf den Knochen üben Bisphosphonate auch eine extraskelettale Wirkung aus. Die Wirkung erfolgt, abhängig vom applizierten Bisphosphonat, über einen Einbau als ATP-Analogon oder über die Hemmung wichtiger Enzyme des Mevalonatstoffwechsels. Bei Letzterem kommt es zur verminderten Bildung von Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat und konsekutiver Beeinflussung wichtiger zellulärer Signalproteine der kleinen GTPasen. Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss verschiedener Bisphosphonate aus unterschiedlichen Generationen (Clodronat, Pamidronat, Ibandronat und Zoledronat) auf den Knochen (Osteoblasten), das Weichgewebe (Fibroblasten) sowie das Gefäßsystem (HUVEC und EPC) zu untersuchen. Des Weiteren soll der Effekt der Substitution des lipophilen Geranyl- Geranyl-Pyrophosphat-Analoga Geranyl-Geraniol analysiert werden. Im Rahmen dieser Studie konnte ein generalisierter inhibitorischer Effekt aller Bisphosphonate auf alle untersuchten Zelllinien festgestellt werden. Hierbei wurde das Migrationsverhalten von humanen Osteoblasten, endothelialen Progenitorzellen, maturen Endothelzellen der Nabelschnur und Fibroblasten durch alle getesteten Bisphosphonate signifikant gehemmt. Bei den Endothelzellen der Nabelschnur (HUVEC) konnte bei allen stickstoffhaltigen Bisphosphonaten (Pamidronat, Ibandronat und Zoledronat) eine signifikante Einschränkung der Migrationsfähigkeit demonstriert werden. Eine Ausnahme bildete hierbei das nichtnitrogenhaltige Clodronat, bei dem dieser Effekt nicht festgestelltbar war. Bei einer Analyse der HUVEC über den MTT Assay zeigten alle Bisphosphonate in einer Konzentration von 50μM eine Einschränkung der Viabilität. Eine signifikante Verminderung der Viabilität bei 5μM konnte nur bei den Bisphosphonaten mit hoherbiologischer Wirksamkeit (Ibandronat und Zoledronat) und nicht bei Clodronat und Pamidronat gezeigt werden. Einen inhibitorischen Einfluss auf die Zellviabilität der Fibroblasten übten nur Clodronat, Pamidronat und Zoledronat in 50μM Konzentration aus. Besonders ausgeprägt war der Einfluss aller Bisphosphonate auf die typische Eigenschaft der EPC, die Formation von Kolonien. Es wurde bei allen Bisphosphonaten ab einer 5μM Konzentration eine signifikante Verminderung dieses zelltypischen Verhaltensmusters festgestellt. Die Zugabe von Geranyl-Geraniol, wie sie im Rahmen sämtlicher durchgeführter Versuchsreihen zusätzlich analysiert wurde, zeigte einen abschwächenden Effekt der Bisphosphonatwirkung. Während bei den Osteoblasten im Migrationsassay eine generalisierte Abschwächung der Bisphosphonatwirkung unter Substitution von Geranyl-Geraniol beobachtet wurde, war dieser Effekt nur bei Ibandronat signifikant. Bei der Versuchsreihe mit Fibroblasten wurde bei allen Bisphosphonaten außer Zoledronat eine signifikante Verbesserung der Migrationstendenz durch die Substitution von Geranyl-Geraniol beobachtet. Der inhibitiorische Effekt bei der Migration konnte bei beiden Zellen der Angiogenese (EPC und HUVEC) durch die Gabe von Geranyl-Geraniol signifikant verbessert werden. Auch bei der Zellviabilität wurde ein abschwächender Effekt der Bisphosphonatwirkung durch Geranyl-Geraniol demonstriert. Dieser war beim MTT Assay bei HUVEC Zellen bei Clodronat in 50μM Konzentration und Zoledronat in 5μM und 50μM Konzentration zu verzeichnen. Die Fibroblasten zeigten eine signifikante Verminderung der Bisphosphonatwirkung durch Geranyl-Geraniol- Substitution bei Zoledronat 50μM und Ibandronat in 5μM und 50μM Konzentration. Geranyl-Geraniol sorgte für eine signifikante Verbesserung der EPC in der Formation von Kolonien in 5μM, 25μM und 50μM Konzentration bei allen getesteten Bisphosphonaten. Bisphosphonate üben einen inhibitorischen Einfluss auf Osteoblasten und extraskelettale Zellen wie Fibroblasten, Endothelzellen (HUVEC) und endotheliale Vorläuferzellen (EPC) aus. Dieser konnte sowohl auf die Zellviabilität als auch auf das Migrationsverhalten dieser Zellen demonstriert werden. Die Subsitution von Geranyl-Geraniol verminderte diesen Effekt. Durch die anaploretische Eigenschaft des Geranyl-Geraniol auf den Mevalonatstoffwechsel könnte eine lokale Verminderung der Bisphosphonatwirkung vielleicht auch in vivo erreicht werden. Dies würde insbesondere zur Behandlung der Bisphosphonat assoziierten Kiefernekrose eine mögliche therapeutische Option darstellen. Diese Eigenschaftsollte in Folgearbeiten weiter untersucht werden und würde einen ersten therapeutischen Ansatz der Bisphosphonat-induzierten Kiefernekrose darstellen.

Summary:
Bisphosphonates are osteoanabolic drugs commonly used in the treatment of bone disseases including malignant bone neoplasia, bone metastasis, muliple myeloma, Paget´s dissease or osteoprosis. Despite their therapeutical properties one main side effect is the development of osteonecrosis of the jaw (BP-ONJ). The pathogenesis of BP-ONJ remains unclear, however it is assumed to be mulitfactoriell. Although the main mechanism of action of bisphosphonates is the inhibition of osteoclasts leading to a reduced bony remodelling, extra-sceletall effects of bisphonsphonates have been published throughout literatur. Regarding the generations of the bisphosphonate there are two different molecular mechanisms of action. While first generation bisphosphates like Clodronate induced their effect by incooperation in an ATP-analoga, recent bisphosphonat generations inhibit enzymes in the mevalonat pathway. This leads to a reduced activation of small GTP-binding proteins. The following cellular signaling-pathways are impaired. The aim of this study was to analyse the impact of four bisphosphonates (Clodronat, Pamidronat, Ibandronat and Zoledronat) on four different celllines (Osteoblasts, Fibroblasts, Endothelial Progenitor Cells and Endothel Cells of the human umbilical cord). Furthermore the influence of geranyl-geraniol substitution should be investigated. The data of the present study revealed a significant depressing effect of all four bisphosphonates on the migration ability of fibroblasts, endothelial progenitor cells and osteoblasts. The nitrogen containing bisphosphonates (pamidronate, ibandronate and zoledronate) had furthermore a significant inhibitory impact on HUVEC. The results of the MTT assay demonstrated a decreased cellviability of HUVEC of all four bisphosphonates in a 50μM concentration. The bisphosphonates with increased biological potency (zoledronat, ibandronat) revealed even an inhibitory effect of cellviability in 5μM concentration. The cellviability of fibroblast was decreased in the MTT assay in 50μM concentration of clodronate, ibandronate and zoledronate. All four bisohosphonates showed a depressing effect on endothelial progenitor cells typical characteristic of colony forming even in a 5μM concentration. Geranyl-Geraniol substitution demonstrated an attenute impact on bisphosphonate effect on all four cell lines. The migration ability of cells of angiogenesis (EPC and HUVEC) was significantly elevated with geranyl-geraniol subsitution of allbisphosphonates. Geranyl-geraniol substitution led to a significantly improved migration ability of fibroblasts when added to the bisphosphonates clodronate, pamidronate and ibandronate. Also a significant increase of migration after geranylgeraniol substitution could be observed in osteoblasts when pretreated with ibandronate. The tests on the viability showed an improvement after geranyl-geraniol subsitution. The viability of fibroblasts could be significantly increased after geranyl-geraniol susbstitution when pretreatment with ibandronate in 50μM or 5μM and zoledronate 50μM concentration had been performed. In HUVEC a significantly enhanced viability could be observed after geranyl-geraniol subsitution in the 50μM clodronate and 5 and 50μM zoledronate group. The impact on the typical characteristic of EPC the colony forming property could be significantly improved after geranyl geraniol subsitution within all four bisphosphonate groups regardsless of the tested concentrations (5, 25 and 50μM). Bisphosphonates have an inhibtory effect on the migration ability of all tested cells. Furthermore they highly influence the cell-viability. Both characterics can be weaked by the subsitution of geranyl-geraniol. These in vitro findings are a promising approach for further testing in an in vivo model as a potential local therapeutical agency against bisphosphonate related osteonecrosis of the jaw.


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