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Titel:Characterization of Ebola Virus VP30 Phosphorylation with a Phosphospecific Antibody
Autor:Lier, Clemens
Weitere Beteiligte: Becker, Stephan (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0292
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-02928
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0292
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Charakterisierung der Ebola Virus VP30 Phosphorylierung mit Hilfe eines phosphospezifischen Antikörpers

Dokument

Schlagwörter:
replication, VP30, Filovirus, Serin, RNA, RNS, Mononegavirales, nucleocapsid, Phosphate, transcription, Nukleokapsid, EBOV, primary transcription, Transkription, Ebolavirus, Phosphata, Transkription, Interaktion, Mononegavirales, Viren, EBOV, VP30, Kinasen, Ebola Virus, Regulation,, NP, RNA, Dephosphorylierung, Antikörper, Replikation, NP, Ebolavirus, Filovirus, Phosphorylierung, Ebola Virus, primäre Transkription, regulation,, Replikation

Summary:
Ebola virus is a nonsegmented negative-strand RNA virus of the family Filoviridae. Ebola virus is highly pathogenic and classified as a BSL-4 agent. In humans, the virus causes a severe, often fatal disease. Replication and transcription of the viral genome are achieved by viral proteins of the nucleocapsid complex, which consists of the viral RNA genome and the viral proteins NP, VP24, L, VP35, and VP30. For replication of the viral genome, only NP, VP35, and L are needed, whereas transcription of individual genes also requires a functional VP30. Previous studies indicated that extensive serine phosphorylation of VP30 impairs viral transcription. Here, we demonstrated that phosphorylation of two VP30 serine residues, namely serine 29 and 31, is both necessary and sufficient for downregulation of VP30's transcriptional support activity. Phosphorylation of VP30 also dynamically modulates the interaction with other viral proteins. For primary transcription immediately after infection of new cells, a phosphorylatable VP30 is a prerequisite. We were able to show that VP30 phosphorylation is essential at early time points of infection to ensure transport of VP30 with the incoming nucleocapsids to the site of primary viral transcription. With the help of a phosphospecific peptide VP30 antibody directed against serine 29 phosphorylation, we further demonstrated that the majority of VP30 is dephosphorylated at position 29 during infection with recombinant Ebola virus. By recombinantly expressing different combinations of viral proteins, we could show that other viral proteins, especially the nucleoprotein NP, decisively influence VP30 phosphorylation. We gathered first evidence showing that VP30 is a substrate of phosphatases recruited by NP into spatial proximity of VP30. Furthermore, we demonstrated that VP30 directly interacts with a so far unknown cellular kinase, which recognizes a common R-X-X-S phosphorylation motif for VP30 serine residue 29. On the basis of these interactions, both VP30-specific phosphatases and kinases are recruited to perinuclear viral inclusion bodies, where they modulate viral transcription and replication.

Zusammenfassung:
Das Ebolavirus gehört zur Familie der Filoviridae, die ein nicht-segementiertes RNA-Genom in negativer Orientierung besitzen. Da das Virus hochpathogen ist und bei Infektion von Menschen eine schwere, oft tödlich verlaufende Krankheit verursacht, wird der Erreger der biologischen Risikogruppe 4 zugeordnet. Replikation und Transkription des viralen Genoms werden durch Proteine des viralen Nukleokapsidkomplexes unterstützt, welcher aus dem RNA-Genom sowie den viralen Proteinen NP, VP24, L, VP35 und VP30 besteht. Während für die Replikation des viralen Genoms NP, VP35 und L ausreichend sind, wird für die Transkription individueller Gene zusätzlich ein funktionstüchtiges VP30 benötigt. Vorangegangene Studien zeigten, dass eine extensive Serin-Phosphorylierung des VP30 zu einer Inhibierung der Transkription führt. In unseren Studien konnten wir nun zeigen, dass die Phosphorylierung von zwei Serin-Resten, genauer gesagt an Serin 29 und Serin 31, sowohl notwendig als auch hinreichend ist, um die Funktion von VP30 als Transkriptionsaktivator herunter zu regulieren. Die Phosphorylierung von VP30 erlaubt auch eine dynamische Interaktion mit anderen viralen Proteinen. Für die primäre Transkription unmittelbar nach der Infektion neuer Zellen muss VP30 phosphorylierbar sein. Wir konnten zeigen, dass die VP30 Phosphorylierung essentiell ist, um den Transport von VP30 mit den Nukleokapsiden zum Ort der primären Transkription sicherzustellen. Mit Hilfe eines phosphospezifischen VP30 Peptidantikörpers, der gegen die Phosphorylierung an Position S29 gerichtet ist, konnten wir darlegen, dass VP30 während der Infektion mit rekombinanten Ebolaviren an Position 29 hauptsächlich dephosphoryliert ist. Während der rekombinanten Expression verschiedener Kombinationen der viralen Proteine zeigte sich, dass andere virale Proteine, besonders das Nukleoprotein NP, die Phosphorylierung des VP30 entscheidend beeinflussen. Wir haben erste Hinweise dafür gesammelt, dass VP30 ein Substrat einer Phosphatase ist, die durch NP in die räumliche Nähe von VP30 rekruitert wird. Darüberhinaus konnten wir zeigen, dass VP30 direkt mit einer bisher unbekannten Kinase interagiert, die ein weit verbreitetes R-X-X-S Phosphorylierungsmotiv für VP30 Serin 29 erkennt. Auf Basis dieser Interaktionen werden die VP30-spezifischen Phosphatasen und Kinasen in virale Einschlusskörper rekrutiert, wo beide Enzyme die virale Transkription und Replikation modulieren.


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