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Titel:Characterizing the Physcomitrella patens ecotype Reute
Autor:Hiß, Manuel
Weitere Beteiligte: Rensing, Stefan A. (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0248
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-02483
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0248
DDC:570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Charakterisierung des Physcomitrella patens Ökotypen aus Reute

Dokument

Schlagwörter:
Laubmoos, Laubmoos, Moss, Sequenzierung,, Promoter, Sequencing, GFP, Ökotyp, Physcomitrella, Promotor

Summary:
Ecotype collections are used for several plant models to unravel the molecular causes of phenotypic differences and to investigate effects of environmental adaptation and acclimation. For the model moss Physcomitrella patens, collections of accessions are available and have been used e.g. for phylogenetic and taxonomic studies, but few were investigated further for phenotypic differences. My thesis focuses on the accession found in Reute close to Freiburg im Breisgau, Germany. My publication shows that the standard laboratory strain Gransden produces fewer sporophytes than Reute or Villersexel K3, although gametangia develop in the same time course and do not show evident morphological differences. My work provides expression profiling and comparative developmental data for several stages of sporophyte development, as well as information on genetic variation from genomic sequencing. There is variation in the expression profiles of several genes between Gransden and Reute, as well as genome segments that are variation hotspots. With my work I propose that Reute is considered a P. patens ecotype and suggest its use for investigations that involve progression through the life cycle and generational succession. In my experiments I used the P. patens ecotype from Reute in molecular biology experiments introducing fluorescent proteins via chemical protoplast transformation to study codon usage bias and select a strong endogenous promoter. The 35S promoter, which is commonly used in plant systems, is only suitable to a limited extent in Physcomitrella patens due to mediocre and non-constitutive activity. Based on a broad range of Gransden and Reute microarray experiments we selected an LHCS gene that is highly expressed in most tissues and treatments. To measure expression strength I developed a novel fluorescence readout system, utilizing a microplate reader and an internal fluorescence control for normalization. The results from my publications demonstrate that the selected promoter is more active than the double 35S and Actin promoters. Deletion constructs were generated to develop a shorter promoter that retains the high activity of the full-length promoter. In parallel, codon bias within P. patens was analysed and demonstrated that the use of several codons is biased and correlates with expression strength. Two GFP variants were synthesized with different sets of codons and compared, showing that optimized codon usage increases the amount of protein under the control of strong promoters. In summary the findings from my publications characterize the P. patens ecotype from Reute and demonstrate that it will be an useful tool in reverse genetic studies.

Zusammenfassung:
Für mehrere in der Forschung verwendete Pflanzenmodelle wurden ausgedehnte Ökotypsammlungen angelegt und diese verwendet um die genetischen Ursachen für phänotypische Unterschiede zu entschlüsseln und um die Anpassung und die Akklimatisierung der Ökotypen zu untersuchen. Auch für das Moos Physcomitrella patens sind Sammlungen aus geographisch getrennten Vorkommen vorhanden die für phylogenetische und taxonomische Studien verwendet wurden. Von diesen Pflanzen wurden aber nur wenige auf phänotypische Unterschiede untersucht oder genauer charakterisiert. Meine Doktorabeit beschäftigt sich mit Physcomitrella patens aus dem Fundort Reute bei Freiburg im Breisgau. Meine Arbeit zeigt, dass der am gängigsten verwendete Stamm aus Gransden Wood, Großbritannien signifikant weniger Sporophyten produziert als die Stämme aus Reute oder Villersexel, Frankreich obwohl sich die Gametangien bei allen drei Stämmen gleich schnell entwickeln und keine direkt sichtbaren phänotypischen Unterschiede aufweisen. Die Expressionsdaten aus verschiedenen Stadien der Sporophytenentwicklung im Stamm Reute und vergleichend dazu aus dem Stamm Gransden zeigen Unterschiede im Expressionsprofil mehrerer Gene und somit eine mögliche Ursache für die Unterschiede in der Sporophytenanzahl. Zur weiteren Charakterisierung der Stämme habe ich die genetischen Unterschiede mittels Genomsequenzierungen bestimmt und finde mehrere Genomabschnitte, die eine erhöhte Anzahl an Einzelnukleotidaustauschen aufweisen. Basierend auf meinen Ergebnissen empfehle ich Physcomitrella patens Reute als Ökotypen zu betrachten welcher sich besonders für Experimente zur Fortpflanzung und zum Generationenwechsel eignet. Des Weiteren verwende ich Reute in molekularbiologischen Experimenten indem ich mittels Protoplastentransformation fluoreszente Proteine einbringe um den Effekt der Codonverwendung zu bestimmen und einen aktiven endogenen Promotor zu finden. Der in Pflanzen häufig verwendete 35S-Promotor zeigt in P. patens nur eine mittlere Aktivität und ist nicht konstitutiv exprimiert. Basierend auf Microarray Daten von Gransden und Reute habe ich den Promotor des LHCSR Gens ausgewählt, welches unter den meisten Versuchsbedingungen eine starke Expression aufweist. Um die Expressionsstärke zu bestimmen habe ich eine Fluoreszenz-Messmethode entwickelt, welche über einen Mikroplatten-Reader und ein zweites Fluoreszenzprotein zur Normalisierung der Messwerte, die Fluoreszenzintensität bestimmt. Der LHCSR Promotor zeigt in meinen Versuchen eine stärkere Expression als der zweifache 35S und der Actin Promotor und eine verkürzte Variante des Promotors zeigt ebenfalls die volle Promotoraktivität. Ich nutze ebenfalls den Effekt der Codonverwendung in P. patens auf die Expressionsstärke und stelle ein codonoptimiertes GFP zur Verfügung. Zusammenfassend charakterisieren meine Ergebnisse den P. patens Ökotypen aus Reute und zeigen, dass er ein hilfreiches Werkzeug für reverse genetische Studien ist.


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