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Titel:Analyse der Acinetobacter lwoffii F78-induzierten proinflammatorischen Signale und der epigenetischen Veränderungen in CD4+ T-Zellen anhand eines in vitro Zellkulturmodells
Autor:Kilic-Niebergall, Esma
Weitere Beteiligte: Renz, Harald (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0137
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0137
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-01372
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Analysis of Acinetobacter lwoffii F78-induced proinflammatory signaling and epigenetic changes in CD4+ T-cells in an in vitro cell culture model

Dokument

Schlagwörter:
Allergie, mikrobielle Exposition, Asthma, Asthma, allergic airways disease, microbial exposition

Zusammenfassung:
Anlässlich für die in den letzten Jahrzehnten stetig steigenden Prävalenzen von Asthma bronchiale in industrialisierten Ländern werden neben einer genetischen Prädisposition vor allem Umweltfaktoren verantwortlich gemacht [177]. Die „Hygiene-Hypothese“ geht davon aus, dass mikrobielle Stimuli allergieprotektiv wirken [194, 195]. Epidemiologische Studien konnten bislang eine Reduktion allergischer Erkrankungen durch Exposition gegenüber mikrobiellen Komponenten im bäuerlichen Umfeld belegen [186, 187]. Infolge wurde der apathogene, gram-negative Keim A. lwoffii F78 aus dem Stallstaub traditioneller Kuhställe isoliert [189-191]. Im Tiermodell führte die intranasale Applikation mit dem Modellkeim A. lwoffii F78 an OVA-sensibilisierte und -provozierte BALB/c-Mäuse zu einer signifikanten Reduktion des asthmatischen Phänotyps [198]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde speziell die Wirkung der Totkeim-Exposition von A. lwoffii F78 auf die allergische Sensibilisierungs- bzw. Entzündungsreaktion in einem akuten Mausmodell der allergischen Atemwegsentzündung untersucht. Sowohl bei der Lebend- als auch bei der Totkeim-Exposition (EtOH abgetötet) von A. lwoffii F78 resultierte die intranasale Behandlung in einer signifikanten Reduktion des asthmatischen Phänotyps. So war die Entwicklung der Atemwegshyperreaktivität, Eosiniphilie als auch die TH2-Zytokinproduktion in der BAL signifikant erniedrigt. Auch die histologische Auswertung der Lungen ließ einen stark verminderten pulmonalen Entzündungsgrad und eine deutlich reduzierte Anzahl an mukusproduzierenden Becherzellen sowie eosinophilen Granulozyten in den Atemwegen aufweisen. Die erfolgreiche Reproduktion der Phänotypen führte in erwünschter Weise zur Entstehung eines protektiven, immunmodulatorischen Effekts von A. lwoffii F78, wobei dieser Effekt von der Totkeim-Exposition nicht beeinflusst wird. Es ist bekannt, dass das proinflammatorische Zytokinmilleu eine wichtige Rolle bei der transmaternalen Asthmaprotektion spielt, welche durch die pränatale Exposition mit dem Keim A. lwoffii F78 vermittelt wird [198]. Innerhalb der eigenen Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die A. lwoffii Exposition der Muttertiere eine Aktivierung des angeborenen Immunsystems zur Folge hat, die mit einer Erhöhung der Zytokine IL-6 und TNFα einhergeht und essentiell für den Asthma-Schutz der Nachkommen ist [198]. In der vorliegenden Arbeit wurde ein in vitro T-Zellsystem etabliert, dass eine genauere Untersuchung der zu Grunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen erlaubt, die unter Beteiligung der innaten und adaptiven Immunantwort eine Rolle bei der Mediation der mikrobiell induzierten Asthmaprotektion durch A. lwoffi F78 und Cholera Toxin spielen. Dazu wurde zunächst die in vitro Analyse des proinflammatorischen Zytokinprofils von Zellen des innaten Immunsystems (murine Makrophagen-Kulturzellen und Peritoneal-makrophagen) nach Stimulation mit A. lwoffi F78 in einer Kinetik durchgeführt. Erwartungsgemäß führte die Stimulation mit A. lwoffi F78 (Lebend-/Totkeim-Exposition) zu einem dosisabhängigen Anstieg der proinflammatorischer Zytokine IL-6 und TNFα auf Proteinebene. Die Stimulation mit CTB zeigte ein ähnliches Zytokinsekretionsmuster von IL-6 und TNFα, wogegen die Behandlung mit dem Cholera Toxin Gesamtprotein (CT) die proinflammatorische Zytokinproduktion nicht beeinflusste. Im zweiten Teil der in vitro Versuchsreihe wurden die Auswirkungen der A. lwoffii F78 stimulierten Makrophagen-Kulturüberstände, die ein signifikantes Expressionsniveau von IL-6 und TNFα aufweisen, auf naive CD4+ T-Zellen in einem im Rahmen der vorliegenden Arbeit etablierten in vitro T-Zellsystem untersucht. Mittels dieser Versuche konnte ein signifikanter Anstieg der T-Zell Zytokinproduktion von IL-17A, IL-10 und IL-13 in CD4+ T-Zellen festgestellt werden. Auch die mRNA-Expression spiegelte in etwa die auf Proteinebene beobachtete Konstellation wieder. Durch den Zusatz rekombinanter Proteine (rhIL-6 und rhTGFβ) bei der in vitro Kultivierung der naiven CD4+ T-Zellen konnte ebenfalls ein signifikanter Anstieg der Zytokine IL-17A, IL-10 und IL-13 detektiert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass das A. lwoffii F78 induzierte proinflammatorische Zytokin IL-6 der innaten Immunzellen (Makrophagen) für die Polarisierung und Sekretion von IL-17A, IL-10 und IL-13 in CD4+ T-Zellen verantwortlich ist. Bei der T-Zell Zytokinproduktion von IL-17A durch Kultivierung von naiven CD4+ T-Zellen mit Cholera Toxin (CT und CTB)- stimulierten Makrophagen-Kulturüberständen spielt das IL-6 jedoch keine zentrale Rolle. In diesem Zusammenhang spielt hier möglicherweise das IL-21, dass bekannter Weise über einen alternativen Signalweg zur Expression von IL-17A befähigt ist, eine entscheidende Rolle bei der Ausrichtung der T-Zellantwort über Cholera Toxin (CT und CTB)-induzierte proinflammatorische Zytokine. Die in diesen Studien erhobenen Daten tragen zu einer Komplettierung und Erweiterung des in vitro Modells der T-zellvermittelten Immunantwort durch mikrobielle Stimuli bei. Erstmals wurden hier immunregulatorische Einflüsse der innaten Immunantwort von A. lwoffii F78 und Cholera Toxin (CT und CTB) auf die in vitro Zytokinexpression der nachgeschalteten, adaptiven Immunantwort einbezogen. So konnte neben den bekannten Subpopulationen ein weiterer unabhängiger T-Helferzell-Subtyp, der IL-17A und IL-10 produzierenden TH17-Zellen, durch die indirekte Stimulation von A. lwoffii F78- bzw. Cholera Toxin-induzierten Zytokinen identifiziert werden. Die oben aufgeführten Zusammenhänge der mediatorvermittelten Interaktion zwischen angeborener und erworbener Immunabwehr über mikrobielle Stimuli im inflammatorischen Geschehen, weisen zumindest in der Theorie vielfältige Perspektiven auf. Denkbar ist unter anderem eine Antagonisierung beteiligter proinflammatorischer Zytokine des TH17-Signalweges oder weiterer Mediatoren bei der Induzierung anti-allergischer, anti-inflammatorischer Signalwege, wie z.B. Chemokin-Antworten. Eine Induktion der kürzlich entdeckten TH17-Zellen durch ein bäuerliches Umfeld, die durch die IL-17-Sekretion regulativ auf die TH1/TH2-Balance einwirken könnte wird in diesem Zusammenhang diskutiert [137]. Um die potentielle allergoprotektive Wirkung des Cholera Toxin bei der mikrobiell vermittelten Asthma-Protektion in vivo zu charakterisieren, wurde im letzen Teil der Arbeit die intranasale Exposition des Cholera Toxin (CT und CTB) im akuten Modell der allergischen Atemwegsentzündung untersucht. Die Charakterisierung des asthmatischen Phänotyps zeigte für die Exposition mit dem CT Gesamtprotein, einen protektiven Effekt auf die Entwicklung des experimentellen Asthma im Mausmodell. Die Behandlung resultierte in einer signifikanten Reduktion der TH2-Zytokine sowie der eosinophilen Granulozyten sowohl in der BAL als auch im Gewebe. Weiterhin zeigten diese Tiere eine tendenzielle Verbesserung der Atemwegsreagibilität. Daneben fanden sich keine Hinweise auf die Initiation einer allergenspezifischen TH1-Antwort (IFNy). Die Analyse der in vivo CTB Exposition zeigte stark erhöhte Konzentrationen der eosinophilen Granulozyten sowohl in der BAL als auch im Gewebe, so dass ein protektiver Effekt ausgeschlossen werden konnte. Um die Relevanz der veränderten proinflammatorischen Zytokinproduktion zu untersuchen wurde nach der in vivo Kurzzeitstimulation mit Cholera Toxin (CT und CTB), die Produktion von IL-6 und TNFα lokal und systemisch untersucht. Die Spiegel der BAL-Zytokindaten korrelierten mit den Resultaten der in vitro Experimente. Die Exposition mit CT zeigte keine Induktion der lokalen Zytokinproduktion von IL-6- und TNFα. Damit sprechen die Daten dieser Arbeit für ein protektives Potential von Cholera Toxin (Wildtyp Gesamtprotein) im Zusammenhang mit allergischem Asthma bronchiale. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die durch Cholera Toxin induzierten Immunmodulations-wirkungen des Zytokinmilleus einen vielversprechenden Ansatz zur Untersuchung IL-6 unabhängiger Signalwege darstellen, die eine Rolle bei der Mediation der anti-allergischen Immunantwort durch Cholera Toxin spielen. Auch wenn die beobachteten Effekte nicht auf eine isolierte „Verdrängung“ einer TH2- durch eine TH1-Immunantwort zurückzuführen sind, scheint ein Zusammenhang zu einer parallel bestehenden TH17-Antwort über IL-6 unabhängige Signalwege wahrscheinlich. Diese mögliche TH17- Immunantwort könnte auf eine allergenspezifische TH2-Antwort gegenregulatorisch wirken und letzten Endes für den anti-allergischen, protektiven Effekt verantwortlich sein. Das hier vorgestellte Mausmodell bietet erstmals die Möglichkeit, Immunmodulationswirkungen des Cholera Toxin in einem akuten Modell der allergischen Atemwegsentzündung zu untersuchen und eröffnet damit neue Perspektiven zur Erforschung der mikrobiell vermittelten Allergieprotektion. Daneben ergeben sich auch interessante Ausblicke für einen möglichen Einsatz des Cholera Toxin in der Immuntherapie des allergischen Asthma beim Menschen. Derzeit stehen bakterielle Antigene im Fokus neuer Behandlungsstrategien bei der Entwicklung einer präventiven Allergenimpfung zur Behandlung von allergischen Erkrankungen. Von erheblicher Bedeutung ist hierbei jedoch nicht die isolierte Einzelsubstanz. Wirkungsvollere Keimcocktails mit unterschiedlichen mikrobiellen Bestandteilen werden im Ganzen betrachtet. Das Wechselspiel der Keime, so früh wie möglich, d.h. während der Reifung und Programmierung des Immunsystems könnte zu einer Toleranzentstehung führen, um eine erfolgreiche Protektion vor Allergie und Asthma zu ermöglichen.

Summary:
In addition to genetic predisposition environmental factors are thought to be responsible for steadily increasing prevalence of asthma bronchiale in industrialized countries in the last decades. The hygiene hypothesis implies that exposure to microbial stimuli prevents from allergic diseases. Recent epidemiological studies have demonstrated a reduction of allergic disease after exposition to microbial components in a farming environment. Subsequently the apathogenic, gram-positive bacterium A. lwoffii F78 was isolated from the stable dust of rural cow sheds [189-191]. Based on these findings, the intranasal exposure of A. lwoffii F78 to Ovalbumin (OVA)-sensitized and -challenged BALB/c-mice significantly reduced the development of an asthmatic phenotype in an animal model of experimental asthma [198]. The aim of the present work was first of all to characterize the effect of exposure to ethanol killed A. lwoffii F78 on the development to the asthmatic phenotype of in an acute mouse model of allergic airway inflammation. In fact, it could be shown that both ethanol killed as well as living intranasal administration of A. lwoffii F78 were able to reduce the asthmatic phenotype significantly in mice. The protective effect of A. lwoffii F78 led to a clear improvement of the airway reactivity in the lung, decreased levels of eosinophilic granulocytes and TH2 cytokine expression in the BAL. The histological analysis of the lungs revealed a highly reduced airway inflammation, reduced number of goblet cells and eosinophilic granulocytes in the airways. Finally, the effectiveness of reproduced phenotypes resulted with development of a protective immune modulatory phenotype induced by A. lwoffii F78, which was not affected in protection by ethanol killed bacteria. It is known that the proinflammatory cytokine response plays an important role in the transmaternal asthma protection, which is mediated by prenatal exposure to A. lwoffii F78 [198]. In our group it has been shown that A. lwoffii F78 exposure to pregnant mother mice led to an activation of the innate immune system accompanied by increased levels of the cytokines IL-6 and TNFα, which are essential for the asthma protection of the progeny [198]. In this study, an in vitro T-cell system was established allowing more detailed investigation of the underlying cellular and molecular mechanisms of the innate and adaptive immune response that play an important role in the mediation of microbial induced asthma protection through A. lwoffi F78 and Cholera Toxin. For this, the first step was the analysis of A. lwoffii induced proinflammatory cytokine profile and kinetic of cells of the innate immune system like murine macrophage culture cells and peritoneal macrophages in vitro. As expected, stimulation with A. lwoffi F78 (living and ethanol killed exposure) led to a dose-dependent increase of proinflammatory cytokines IL-6 and TNFα at the protein level. The treatment with cholera toxin b-subunit (CTB) showed a similar cytokine profile of IL-6 and TNFα, whereas by treatment with the cholera toxin total protein (CT) proinflammatory cytokine expression was not affected. In the next part of the in vitro studies the effects of A. lwoffii F78 stimulated macrophage culture supernatants containing significant levels of expressed IL-6 and TNFα, on naive CD4+ T-cells, were analysed using a new established in vitro T-cell system. By means of these experiments a significant increase of T-cell cytokine production of IL-17A, IL-10 and IL-13 in CD4+ T-cells were detected. The observed mRNA expression reflected approximately indeed levels of the protein expression. By the addition of recombinant proteins (rhIL-6 and rhTGFβ) during the in vitro culturing of naive CD4+ T-cells a significant increase of the cytokines IL-17A, are IL-10 and IL-13 were detected too. Thus, these results allowed drawing the conclusion that the A. lwoffii F78 induced proinflammatory cytokine IL-6 of the innate immune cells (macrophages) is responsible for polarizing and secretion of IL-17A, IL-10 and IL-13 in CD4+ T-cells. However the T-cell cytokine production of IL-17A by culturing of naive CD4+ T-cells with cholera toxin stimulated macrophage culture supernatants, IL-6 plays no pivotal role. In this regard, the IL-21 which is well known for induction of IL-17A expression via alternative signaling pathways, may play a crucial role on the formation of the T-cell response by cholera toxin induced proinflammatory cytokines. Consequently, collected data of these studies redound a completing and extension of the in vitro model of T-cell mediated immune response by microbial stimuli. These data demonstrate for the first time, immunoregulatory effects of the innate immune response by A. lwoffii F78 and cholera toxin were involved to analysis of in vitro cytokine expression by the downstream, adaptive immune response. Thus, besides being known corresponding subpopulations an independent T helper cell subtype of IL-17A and IL-10-producing TH17 cells could be identified by this indirect stimulation with A. lwoffii F78 and cholera toxin-induced cytokines. As already described, mediator-induced interactions between innate and adaptive immunity via microbial stimuli in inflammatory reactions, possessed hypothetically diverse perspectives. Still, it is conceivable that involved proinflammatory cytokines or further mediators of the TH17 signaling pathway antagonize for induction of an anti-allergic, anti-inflammatory signaling pathway (e.g. chemokine responses). In this context, there is discussion about induction of recently discovered TH17 cells by a rural environment may have regulating effect on TH1/TH2 balance by IL-17 secretion [137]. In the last part of this work the intranasal exposure of cholera toxin (CT and CTB) has been analysed in an acute model of allergic airway inflammation to characterize the potential allergoprotective effect of cholera toxin in microbially-mediated asthma protection. The analysis of the asthmatic phenotype revealed a protective effect on the development of experimental asthma in mice by intranasal exposure to CT total protein. This treatment resulted in a significant reduction of TH2 cytokines and the eosinophil granulocytes in the BAL as well as in the tissue. Furthermore, these animals showed a tended improvement of the airway hyper responsiveness. In addition, there was no initiation of an allergen-specific TH1 response (IFNγ) found. However, the analysis of CTB administration revealed elevated levels of eosinophils in both the BAL and the tissue. Therefore protective properties could be excluded for CTB administration in vivo. Additionally, to investigate the relevance of the modified proinflammatory cytokine production, the expression of IL-6 and TNFα was investigated locally and systemically after short term stimulation with CT and CTB in vivo. This in vivo treatment correlated with the results of in vitro experiments regarding levels of BAL cytokine expression. Altogether, there was no induction of an altered locally cytokine secretion of IL-6 and TNFα by short term stimulation with CT. Thus, these data provide the first evidence of a protective potential of cholera toxin (CT) associated with allergic asthma. Furthermore, the results of cholera toxin induced immunomodulatory response by cytokine profile represent a promising approach for examination of IL-6 independent signaling pathways that play a role in the mediation of anti-allergic immune response by cholera toxin. Although the observed effects are not due to an isolated repression of a TH2 by a TH1 immune response, a parallel existing TH17 response through IL-6 independent signaling pathways seems likely. This response is presumably counteracting to an allergen-specific TH2 response and accountable for the anti-allergic, protective effect. The represented mouse model provides new opportunities to examine immunomodulatory effects of cholera toxin in an acute model of allergic airway inflammation and offers new perspectives to the study microbially mediated allergy protection. Furthermore, interesting views on the possible use of cholera toxin in the treatment of allergic asthma in human can now be offered. Currently, bacterial antigens are the focus of new treatment strategies for development of a preventive allergen vaccination to protect against allergic diseases. However, the relevance of these antigens are not isolated single substances. More efficient mix of bacterial cocktails with different microbial components are in consideration. The early interaction of different microbial factors during maturation and programming of the immune system could lead to tolerance formation to develope a successful prevention of allergies and asthma.


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