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Titel:Establishment of new experimental models of progressive prodromal Parkinson’s disease using viral-mediated overexpression of wild-type human α-synuclein in the substantia nigra compacta and the locus coeruleus in mice
Autor:Lee, Bolam
Weitere Beteiligte: Oertel, Wolfgang (Prof. Dr. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0136
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-01369
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0136
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Etablierung neuer experimenteller Modelle der progressiv prodromalen Parkinsonkrankheit durch viral-mediierte Überexpression des menschlichen α-Synuclein Wildtyps in der Substantia nigra compacta und dem Locus coeruleus in Mäusen

Dokument

Schlagwörter:
α-Synuclein, Parkinsonkrankheit, α-Synuclein

Summary:
Part 1. Summary Alpha-7-nicotine-acetylcholine-receptor (α7-nAChR) agonists modulate the cholinergic anti-inflammatory pathway to attenuate proinflammatory signals and reduce dopaminergic neuronal cell loss in toxin-induced experimental murine models of Parkinson’s disease (PD). However, no research has been performed to evaluate the effect of α7-nAChR agonists in human α-synuclein (hαSyn) mediated models of PD. We, therefore, investigated the effect of the compound JN403, an α7-nAChR specific agonist, in αSyn treated in-vitro microglia culture and human αSyn overexpression in-vivo mouse model of PD. In primary mouse microglia cells, αSyn fragment 61-140 treatment increased the release of nitric oxide (NO), TNF-α and IL-6, and decreased cell viability. 100 nM of JN403 pre- and co-incubation significantly reduced the level of NO and TNF-α release in the microglial cells. However, cell viability and IL-6 cytokine release did not revert to control level. For in-vivo testing of JN403, unilateral intranigral overexpression of WT-αSyn or of the control protein luciferase (luc) was induced in C57/BL6N mice via stereotaxic delivery of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Targeted WT-αSyn overexpression reduced 20% of the number of tyrosine hydroxylase (TH) immunoreactive (ir) nigral neurons after 10 weeks. Subcutaneous daily treatment of 30 mg/kg JN403 over 9 weeks starting at postoperative week 1 did not reverse the decline of the number of TH-ir nigral neurons (nor Iba1-ir density) in WT-αSyn overexpression mouse model. The reduced density of TH-ir striatal terminals in the WT-αSyn groups was also not recovered by the JN403 treatment. In summary, JN403, an α7-nAChR specific agonist shows a beneficial effect on ameliorating proinflammatory signals in αSyn exposed microglia cells. However, no significant treatment effect is found in an intranigral WT-αSyn overexpression in-vivo mouse model with JN403 therapy employed. Part 2. Summary The locus coeruleus (LC) is a small nucleus among the catecholaminergic cell groups, but it has extensively branched axons, and it innervates broad areas in the brain. According to the widely accepted Parkinson’s disease (PD) staging model of Braak, the LC is affected by alpha-synuclein (αSyn) pathology at the second stage, but the possible neurochemical changes induced by axonal αSyn-transport from the LC have never been investigated. Therefore, we overexpressed human wild-type αSyn (WT-αSyn) or the control protein Luciferase (Luc) in the mouse LC via unilateral stereotaxic delivery of recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) and subsequently investigated pathological alterations in a time-dependent manner. Unbiased stereology demonstrated that the number of LC neurons did not significantly decrease upon WT-αSyn overexpression, yet rigorous microgliosis and astrogliosis occurred post 3 weeks post-injection. Intriguingly, the number of choline acetyltransferase (ChAT) immunoreactive (ir) neurons in the dorsal motor nucleus of the vagus (DMnX) and in the nucleus ambiguus (nAmb) significantly decreased in the αSyn group as early as 3 weeks. The putative axonal connectivity between the LC and the cholinergic motor nuclei as well as the loss of ChAT-ir were further elucidated by microinjection of Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter-specific viral vectors (rAAV2/5-TH-EGFP or WT-αSyn) in the LC. We found robust αSyn-ir axonal varicosities around the DMnX neurons, and remarkably, intraneuronal αSyn was present in the ambiguus neurons in both hemispheres 3 weeks post-injection. As the compact formation of the nAmb controls the esophagus, we investigated the presence of αSyn in the cervical, thoracic and abdominal parts of the esophagus tissues of injected mice. As a result of aSyn overexpression in the LC, we observed αSyn-ir cells and varicosities in the muscle layers, and notably, some of these αSyn-ir neurons co-localized with myenteric plexus ganglia post 3 and 9 weeks. Furthermore, we found that, unlike the majority of the Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) signals, some nerve endings were weak in signal and dispersed from the motor receptors. Our data reveal that LC neurons induced the transsynaptic and transneuronal spreading of αSyn in the vagal motor nuclei and suppressed cholinergic efferents terminating on motor endplates in the esophagus. It appears that αSyn can travel through anatomically connected brain regions as proposed in the early staging model of PD; implying α-synucleinopathy in noradrenergic neurons may potentially disturb the cholinergic modulation of the upper gastrointestinal tract rostral-caudally.

Zusammenfassung:
Part 1. Summary Alpha-7-nikotinische Acetylcholin-Rezeptor (α7-nAChR) -Agonisten modulieren den cholinergen anti-inflammatorischen Signalweg, indem sie proinflammatorische Signale abschwächen und den Verlust von dopaminergen Nervenzellen in Toxin-induzierten Mausmodellen der Parkinson-Krankheit (PD) reduzieren. Allerdings fehlen Studien, die die Wirkung von α7-nAChR-Agonisten in PD-Modellen mit humanem Alpha-Synuklein (hαSyn) testen. Wir untersuchten daher die Wirkung des spezifischen α7-nAChR-Agonisten JN403 in-vitro in hαSyn-behandelten Mikroglia-Zellkulturen sowie in-vivo in Mausmodellen mit hαSyn-Überexpression. In den unbehandelten murinen Mikrogliazellen erhöhte die Behandlung mit dem hαSyn-Fragment 61-140 die Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO), TNF-α und IL-6 und verringerte die Viabilität der Zellen. Die Vor- und Ko-Inkubation mit 100 nM JN403 dazu reduzierte die Menge an NO- und TNF-α-Freisetzung in den Mikrogliazellen signifikant. Die Viabilität der Zellen und die IL-6-Freisetzung kehrte jedoch nicht auf das Kontrollniveau zurück. Für das in-vivo Experiment mit JN403 wurde in C57/BL6N-Mäusen eine unilaterale intranigrale Überexpression von WT-αSyn bzw. des Kontrollproteins Luciferase (luc) durch stereotaktische Verabreichung eines rekombinanten adeno-assoziierten Virus (rAAV)-Vektors induziert. Die gezielte WT-αSyn-Überexpression reduzierte nach 10 Wochen 20% der Tyrosinhydroxylase (TH)-immunoreaktiven (ir) nigralen Neurone. Eine tägliche subkutane Behandlung mit 30 mg/kg JN403 über 9 Wochen ab der ersten postoperativen Woche konnte den Verlust der TH-ir nigralen Neurone nicht aufhalten (noch die der Iba1-ir-Dichte). Die reduzierte Dichte von TH-ir striatalen Endigungen in WTαSyn-Gruppen war auch nach JN403-Behandlung unverändert. Zusammenfassend reduzierte der spezifische α7-nAChR-Agonist JN403 proinflammatorische Zytokine in αSyn-exponierten Mikrogliazellen in-vitro, jedoch konnten wir unter der Behandlung mit JN403 keinen signifikanten Effekt im in-vivo Mausmodell mit intranigraler Überexpression von WT-αSyn finden. Part 2. Summary Der Locus Coeruleus (LC) ist ein kleiner Nukleus unter den katecholaminergen Zellgruppen, aber er hat stark verzweigte Axone und innerviert dadurch große Bereiche im Gehirn. Nach dem akzeptierten Staging-Modell der Parkinson-Krankheit (PD) von Braak ist der LC ab der zweiten Staging-Phase von Alpha-Synuklein (αSyn)-Pathologie betroffen. Die möglichen neurochemischen Veränderungen durch axonale αSyn-Übertragung aus dem LC wurden allerdings bislang nie untersucht. Daher überexprimierten wir humanes Wildtyp αSyn (WT-αSyn) bzw. das Kontrollprotein Luciferase (Luc) im LC durch einseitige stereotaktische Gabe von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) Vektoren und untersuchten anschließend pathologische Veränderungen in Abhängigkeit der Zeit. Eine unvoreingenommene Stereologie zeigte, dass die Anzahl der LC-Neuronen nach WT-αSyn-Überexpression nicht signifikant abnahm, jedoch traten 3 Wochen nach der Injektion ausgeprägte Mikrogliose und Astrogliose auf. Interessanterweise nahm die Anzahl der Cholinacetyltransferase (ChAT)-immunoreaktiven (ir) Neurone im dorsalen motorischen Nucleus des Nervus vagus (DMnX) und im Nucleus ambiguus (nAmb) in der αSyn-Gruppe bereits nach 3 Wochen signifikant ab. Die mutmaßliche axonale Konnektivität zwischen dem LC und den cholinergen motorischen Kernen sowie der Verlust von ChAT-ir wurden durch Mikroinjektion von Tyrosin-Hydroxylase (TH) -Promotor-spezifischen viralen Vektoren (rAAV2/5-TH-EGFP/WT-αSyn) in den LC weiter aufgeklärt. Wir fanden robuste αSyn-ir-axonale Varikositäten um die DMnX-Neurone und erstaunlicherweise auch intraneurales αSyn in Neuronen des nAmb in beiden Hemisphären 3 Wochen nach der Injektion. Da die pars compacta des nAmb die Speiseröhre innerviert, suchten wir nach αSyn in den zervikalen, thorakalen und abdominalen Teilen des Ösophagusgewebes der WT-αSyn-injizierten Mäuse und der Kontroll-Mäuse. Als Ergebnis der aSyn-Überexpression im LC beobachteten wir αSyn-ir-Zellen und Varikositäten in den Muskelschichten. Bemerkenswerterweise waren einige dieser αSyn-ir-Neuronen nach 3 und 9 Wochen mit Plexusganglien des Plexus myentericus kolokalisiert. Darüber hinaus fanden wir, dass im Gegensatz zu den meisten Signalen des vesikulären Acetylcholin-Transporter (VAChT) einige Nervenendigungen schwach und von den motorischen Rezeptoren entfernt waren waren. Unsere Daten zeigen, dass es zu transsynaptischem und transneuronalem „Spreading“ von αSyn vom LC in die vagalen motorischen Kernen kommt, was zur Suppression von cholinergen Efferenzen an den motorischen Endplatten in der Speiseröhre führt. Es scheint, dass αSyn über anatomisch verbundene Hirnregionen wandern kann, wie bereits im Braak Staging-Modell von PD postuliert, und dass eine α-Synuklein-Pathologie in noradrenergen Neuronen möglicherweise die cholinerge Modulation des rostral-kaudalden oberen Gastrointestinaltrakts stört.


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