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Titel:Bifunctionality: New Insights into the Class of (6-4)Photolyases and animal-like Cryptochromes
Autor:Franz-Badur, Sophie Elisabeth
Weitere Beteiligte: Essen, Lars-Oliver (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0104
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0104
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-01046
DDC: Chemie
Titel(trans.):Bifunktionalität: Neue Einblicke in die Klasse der (6-4) Photolyasen und animal-like Cryptochrome

Dokument

Schlagwörter:
Photoreceptor, Strukturbiologie, Cryptochrome, Biochemie, Cryptochormes, Strukturbiologie, Elektronentransfer, electron transfer, Biochemie, Photorezeptoren, Photorezeptor, Photolyases, Cryptochrom, Photolyasen

Summary:
The cryptochrome/photolyase family (CPF) is a huge protein family of blue-light photoreceptors, which occur in all kingdoms of life. All members of this family utilize a flavin chromophore as catalytic cofactor and show high sequence and structural similarity, although they have different functions inside the living organism. Photolyases use the energy of light to repair UV-light induced DNA lesions like the cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) or the pyrimidine-(6-4)-pyrimidone photoproduct ((6-4)PP). Cryptochromes, on the other hand, are involved in many different blue-light regulated mechanisms, like the photoperiodic flowering in plants and the entrainment of the circadian rhythm in animals. This study focuses on the characterization of the photoreduction and (6-4) repair mechanism of the subclass of animal cryptochromes and (6-4) photolyases on the basis of the animal-like cryptochrome from the green algae Chlamydomonas reinhardtii (CraCRY). Through multiple sequence alignment with other CPFs and mutational studies, the specific residues involved in the photoreduction mechanism were successfully identified, leading to the discovery of a tyrosine as distal electron donor at the end of the conserved tryptophan triad. The photoreduction, with regard to the formation and decay of a tyrosyl radical, was extensively studied with several spectroscopic methods. All analyses resulted in the observation of an unusually long-lived tyrosyl radical upon photoreduction. As it turned out, CraCRY is not only a cryptochrome, but also has (6-4) photolyase function, which makes it a bifunctional member of this group. To study structure-function relationships, the 3D structure of CraCRY in complex with its chromophores as well as a (6-4)PP was solved by X-ray crystallography. The structure reveals a new binding mode of the DNA lesion and provides insight into the active site. One of the essential residues for DNA repair (His1) exhibits a different conformation as in the common model, which may indicate an alternative mechanism for (6-4)PP repair. The main knowledge about cryptochrome structures derived from the comparison with photolyases, but cryptochromes contain a highly variable C-terminal extension (CTE), which is missing in photolyases. In CraCRY this CTE is about 100 amino acids long and not shown in the solved crystal structure. For analysis of the CTE, hydrogen-deuterium-exchange coupled with mass spectrometry was used including a comparison of different reduction. Although, the coverage of the CTE was incomplete, there were significant changes between the oxidized and fully reduced state FADH− detectable. It was concluded, that the photoreduction process and the formation of the tyrosyl radical is triggering a structural change in the region between the loop carrying the tyrosyl radical and the C-terminal α22-helix. For further investigation of the intramolecular changes upon photoreduction and DNA repair, time-resolved crystal measurements of a class II CPD photolyase (MmCPDII) and CraCRY were performed within a joint project at the free electron laser SACLA. So far, the different conformations of the flavin cofactor of MmCPDII in its different oxidation states have been successfully derived. In future, it is expected to show the whole repair mechanism for the CPD lesion as well as for the (6 4)PP by time-resolved SFX.

Zusammenfassung:
Die Familie der Cryptochrome und Photolyasen (CPF) ist eine große Proteinfamilie von Blaulicht Photorezeptoren, welche in allen Bereichen des Lebens vertreten sind. Alle Vertreter dieser Familie verwenden einen Flavinchromophor als katalytischen Kofaktor und zeigen hohe Sequenz- und Strukturähnlichkeiten, obwohl sich ihre Funktionen in lebenden Organismen stark unterscheiden. Einerseits verwenden Photolyasen die Energie des Sonnenlichts zur Reparatur von UV-induzierten DNA Schäden wie dem Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer (CPD) Schaden oder dem Pyrimidin-(6-4)-Pyrimidon Photoprodukt ((6 4)PP). Cryptochrome sind andererseits involviert in verschiedenen Blaulicht-regulierten Mechanismen, wie zum Beispiel die photoperiodischen Blühzeiten in Pflanzen oder die Regulierung des circadianen Rhythmus in Tieren. Diese Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung der Photoreduktion sowie des (6 4) Reparaturmechanismus einer Untergruppe von tierischen Cryptochromen und (6 4) Photolyasen anhand des animal-like Cryptochromes aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii (CraCRY). Durch multiple Sequenzvergleiche mit anderen CPFs und Mutationsstudien konnten die spezifischen und für die Photoreduktion relevanten Aminosäure-Reste identifiziert werden. Dies führte zur Entdeckung eines Tyrosins als vierten Elektronendonor am Ende der konservierten Tryptophantriade. Die Photoreduktion wurde weiterhin mit verschiedenen spektroskopischen Methoden untersucht mit besonderem Augenmerk auf der Entstehung und den Abbau des Tyrosylradikals. Wie gezeigte wurde, handelt es sich bei CraCRY nicht nur um ein Cryptochrom, sondern es zeigt darüber hinaus (6-4)-Photolyase Aktivität, was es zu einem bifunktionellen Mitglied der CPF macht. Um die Beziehung zwischen Struktur und Funktion zu untersuchen, habe ich die 3D-Struktur von CraCRY im Komplex mit seinen Chromophoren sowie einem (6-4)PP per Röntgenstrukturanalyse entschlüsselt. Dabei zeigte sich ein neuer Modus für die DNA Bindung sowie ein detaillierter Einblick in die aktive Tasche. Ein essentieller Rest für die DNA Reparatur (His1) wies eine veränderte Konformation im Vergleich zu dem bisher veröffentlichen Model auf. Dies könnte auf einen alternativen Reparaturprozess für (6-4)PP hindeuten. Die wissenschaftlichen Erkenntnisse über die Struktur von Cryptochromen basieren vor allem auf dem Vergleich zu Photolyasen, jedoch besitzen Cryptochrome einen elongierten C-Terminus (CTE), welcher den Photolyasen fehlt. Dieser CTE ist in CraCRY ca. 100 Aminosäuren lang und nicht in der Kristallstruktur enthalten. Um den CTE weiter zu analysieren wurde Wasserstoff-Deuterium-Austausch gekoppelt mit Massenspektrometrie durchgeführt und die unterschiedlichen Reduktionszustände miteinander verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse decken zwar den CTE nicht vollständig ab, jedoch konnten klare Unterschiede zwischen den Reduktionszuständen festgestellt werden. Daraus können wir schließen, dass es durch die Bildung des Tyrosylradikals bei der Photoreduktion zur Umstrukturierung im Bereich der Tyr-Schleife sowie der C-terminalen α22-Helix kommt. Um die intramolekularen strukturellen Veränderungen durch die Photoreduktion und DNA-Reparatur weiter zu untersuchen, wurde zeitaufgelöste Röntgenstrukturanalyse am freien Elektronenlaser SACLA mit einer Klasse II CPD Photolyase (MmCPDII) und CraCRY durchgeführt. Dadurch war es möglich geworden die verschiedenen Konformationen des MmCPDII Flavinchromophors in seinen unterschiedlichen Oxidationszuständen zu zeigen. Diese Arbeiten legen den Grundstein dafür, dass der komplette Reparaturmechanismus der CPD sowie (6-4) Schäden durch zeitaufgelöste SFX aufgelöst werden kann.


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