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Titel:Liposomale Formulierungen von Hypericin zur Anwendung in der photodynamischen Therapie
Autor:Plenagl, Nikola
Weitere Beteiligte: Bakowsky, Udo (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0077
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0077
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-00771
DDC: Pharmacology & therapeutics, prescription drugs
Titel(trans.):Hypericin loaded liposomes for photodynamic therapy

Dokument

Schlagwörter:
photodynamische Therapie, antitumoral, antibakteriell, Hypericin, Liposomen

Zusammenfassung:
In dieser Arbeit wurde die Entwicklung von liposomalen Hypericinformulierungen und die Untersuchung der photodynamischen Aktivität derselben auf Bakterien und Tumorzellen dargestellt. Da Hypericin sehr lipophile Eigenschaften besitzt und in wässrigen Lösungen Aggregate bildet, ist die klinische Applikation eine große Herausforderung und verlangt nach einer stabilen wässrigen Formulierung des Photosensitisers. Zwei verschiedene Strategien zur Verkapselung von Hypericin in Liposomen sollten hierbei verglichen werden. Zum einen wurde Hypericin mit Hilfe der Filmmethode mit den hydrophoben Resten der Lipide in der Liposomenmembran assoziiert und zum anderen wurde eine Einschlussverbindung aus Hypericin und HPβCD mit Hilfe der DRV-Methode in das wässrige Kompartiment der Liposomen eingeschlossen. Der Heranführung an das Thema in Kapitel 1 folgt die Zusammenfassung und Erläuterung der in dieser Arbeit verwendeten Herstellungs- und Charakterisierungsmethoden in Kapitel 2. Kapitel 3 beschäftigt sich mit der Charakterisierung der Liposomen. Mit Hilfe von DLS, LDA, AFM und SEC wurde der hydrodynamische Durchmesser, der PDI, das Zetapotential, die Morphologie, die Verkapselungseffizienz sowie die Stabilität während der Lagerung oder in Anwesenheit von Serum untersucht. Alle Formulierungen zeigten einen hydrodynamischen Durchmesser zwischen 127 und 212 nm und einen PDI zwischen 0,21 und 0,32. Das Zetapotential war im Fall der DRV-Liposomen besonders niedrig, was vermuten lässt, dass der Hypericin-Komplex auch auf der liposomalen Membran adhäriert. Die AFM-Aufnahmen zeigten kugelförmige Vesikel und somit eine für Liposomen charakteristische Morphologie. Die Einschlusseffizienz der DSPC Liposomen konnte durch die DRV-Methode deutlich gesteigert werden. Liposomen die zusätzlich TEL als Membranbestandteil enthielten verkapselten mehr Hypericin als ihre Pendants, welche nur aus DSPC bestanden. In den Studien zur Lagerstabilität konnte gezeigt werden, dass der Zusatz von Cyclodextrin auch nach drei Wochen Lagerung bei 4 °C keine Veränderungen von Größe, PDI oder Zetapotential verursacht. Außerdem zeigten die Formulierungen eine ausreichende Stabilität in IMDM oder 60% FKS. In Kapitel 4 sind die photodynamischen Wirkungen der Liposomen auf Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis und E. coli DH5α dargestellt. Des Weiteren wurde die Bindung der Liposomen an die grampositiven Bakterien mit Hilfe eines Bindungsassays und CLSM- Aufnahmen untersucht. E. coli DH5α zeigte keine Sensitivität gegenüber der PACT mit Hypericin, Hyp-HPβCD oder Hypericin-Liposomen. Es war nicht möglich mit Hilfe der Liposomen die äußere Membran der gramnegativen Bakterien, welche eine starke Permeationsbarriere darstellt, zu durchdringen. Bezüglich der PACT von grampositiven Bakterien waren die DRV-Liposomen den nach der Filmmethode hergestellten Vesikeln überlegen. Den stärksten Effekt erzielten DSPC/Hyp-HPβCD Liposomen mit einer bakteriellen Reduktion von 4,1 log10. Der Bindungsassay unterstützte das Ergebnis der in vitro Versuche, indem er zeigte, dass die DSPC/Hyp-HPβCD Liposomen auch am meisten PS an oder in die Bakterienmembran transportierten. Um sich in vivo Versuchsbedingungen anzunähern, wurde die beste liposomale Formulierung im Hühnerembryomodell getestet. Diese Ergebnisse sind in Kapitel 5 zusammengefasst. Interessanterweise zeigen hier, im Gegensatz zu den in vitro Studien, die DSPC/Hyp-HPβCD Liposomen eine stärkere antibakterielle Wirkung als der freie Komplex. Die Liposomen bewirkten eine durchschnittliche Verringerung der Bakterienlast von 1,2 log10. Kapitel 6 befasst sich mit der photodynamischen Wirkung der Hypericinformulierungen auf Biofilmen von Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis. Außerdem wird mit Hyp-HPβCD und/oder DSPC/Hyp-HPβCD beschichtetes Kathetermaterial auf seine Antibiofilm-Wirkung untersucht. Als Bestandteil einer Oberflächenbeschichtung von PUR erzielte der Komplex eine Verringerung der Biofilmbakterien um 4,3 log10. Diese Wirkung konnte unter zusätzlicher Anwendung von Ultraschall auf 6,8 log10 Reduktion der Bakterienanzahl gesteigert werden. Insgesamt lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass photodynamische Beschichtungen von Kathetermaterial einen guten Ansatz zur Bekämpfung von Katheter-assoziierten Infektionen darstellen können. Kapitel 7 beschäftigt sich mit dem Einsatz der Liposomen für die antitumorale Therapie. Dabei wurden DRV-Liposomen bestehend aus DPPC/TEL oder DSPC mit Filmmethode-Vesikeln der gleichen Zusammensetzung verglichen. Die photodynamische in vitro Aktivität auf SK-OV-3 Zellen war für alle Formulierungen konzentrationsabhängig. Im Gegensatz zu den DRV-Liposomen zeigten die konventionellen Liposomen bei einer geringen Fluenz von 2,1 J/cm² bereits einen phototoxischen Effekt. Während der Steigerung der Fluenz bis zu 12,4 J/cm² glich sich die phototoxische Wirkung der Formulierungen an. Des Weiteren war der photodynamische Effekt der Liposomen von der Inkubationszeit abhängig. Die ideale Inkubationszeit lag bei 4 h. Der qualitative Nachweis der Liposomenaufnahme in die Zellen erfolgte mit Hilfe der Konfokalmikroskopie. Die Liposomen scheinen dabei das Hypericin in einem jeweils ähnlichen Umfang zu den Zellen zu transportieren. Lediglich der freie Komplex zeigte eine stärkere Fluoreszenz innerhalb der Zellen. Nichtdestotrotz ist eine Verkapselung des Komplexes sinnvoll, da das in vivo Schicksal desselbigen besser kontrolliert und somit mehr Hypericin zielgerichteter zum Tumorgewebe gelangen kann. Die Untersuchung der Endozytosewege lässt vermuten, dass die DRV-Liposomen hauptsächlich über die Clathrin-vermittelte Endozytose aufgenommen werden. Die konventionellen Liposomen hingegen scheinen das Hypericin zu einem überwiegenden Teil auch über andere Pathways in die Zellen zu transportieren. Neben der direkten Zelltoxizität ist auch der antivaskuläre Effekt der Formulierungen für die antitumorale Therapie von Interesse. Der Hämolyse-Assay und die aPTT-Zeit weisen darauf hin, dass die Formulierungen hämokompatibel und somit für die intravenöse Applikation geeignet sind. Diese erfolgte in ovo in das Gefäßsystem der CAM. Die Ergebnisse dieser CAM-Studien sind in Kapitel 8 zusammengefasst. Die DRV-Liposomen zeigen hierbei einen moderaten bis keinen antivaskulären Effekt, während die konventionellen Liposomen starke Schäden an den Mikrogefäßen verursachen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die konventionellen Liposomen gut für die antivaskuläre Therapie geeignet sind, da sie Hypericin zu den Endothelzellen und ins Blut transportieren. Die DRV-Liposomen hingegen scheinen den Wirkstoff sehr stabil zu verkapseln und ihn vor Licht abzuschirmen. Daher liegt die Vermutung nahe, dass diese Art der Verkapselung geeignet ist, mehr Hypericin an den Zielort Tumor zu transportierten, indem eine frühzeitige Freisetzung des Hypericins in die Blutbahn durch die spezielle Verkapselung verhindert wird. Zusammenfassend ist es gelungen, stabile liposomale Formulierungen von Hypericin herzustellen, die für die antibakterielle und antitumorale photodynamische Therapie geeignet sind und sowohl lokal als auch intravenös verabreicht werden können.

Summary:
The purpose of this doctoral thesis was the development of liposomal hypericin formulations and the investigation of their photodynamic activity against bacteria and tumour cells. Since hypericin is very lipophilic and forms aggregates in aqueous solutions, clinical application is a challenge and requires the development of an aqueous hypericin formulation. For this purpose, two different strategies to encapsulate hypericin into liposomes viz. hypericin incorporated within the liposomal membrane prepared by thin film hydration method and its cyclodextrine complex encapsulated inside the aqueous milieu of the liposome prepared by dehydration-rehydration method were compared. Chapter 1 of the thesis introduces the reader to the background and state of art in PDT and liposomal technology. This is followed by Chapter 2 which deals with the summary and explanation of the methods employed. Chapter 3 involves the characterisation of the liposomes. Hydrodynamic diameter, PDI, zeta potential, morphology, encapsulation efficiency and the stability during storage or in the presence of serum were determined with photon correlation spectroscopy (PCS), laser doppler anemometry (LDA), atomic force microscopy (AFM) and size exclusion chromatography (SEC) respectively. All formulations characterised showed a hydrodynamic diameter ranging between 127 and 212 nm and a PDI between 0.21 and 0.32. The zeta potential was especially low in case of dehydration-rehydration vesicles (DRV). This leads to the hypothesis that the Hyp-HPβCD complex also adheres on the liposomal surface. The AFM micrographs confirmed the typical morphology of liposomes showing spherically shaped vesicles. Liposomes composed of DPPC/TEL encapsulated more hypericin than their DSPC counterparts. The stability studies showed that the formulations were stable in cell culture medium or 60% FCS. The photodynamic activity of hypericin liposomes on Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis and E. coli DH5α is summarised in Chapter 4 of the thesis. Additionally, CLSM micrographs and binding assay served as qualitative and quantitative analysis of hypericin delivery in gram positive bacteria. E. coli DH5α was not susceptible to hypericin, Hyp-HPβCD or hypericin liposome mediated photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Concerning the PACT of gram-positive bacteria, the DRV vesicles were more effective than conventional liposomes prepared using the thin-film hydration method. The strongest effect could be seen using DSPC/Hyp-HPβCD liposomes, which led to a bacterial reduction of 4.1 log10¬. In order to build a bridge between in vitro and in vivo, the best formulation was tested in the chick embryo model. Interestingly, the results, which are presented in Chapter 5, were quite opposite to the in vitro studies. The DSPC/Hyp-HPβCD liposomes led to a decrease of the bacterial load of 1.2 log10 and thus showed a stronger antibacterial effect than the complex. Chapter 6 evaluates the photodynamic activity of hypericin liposomes on biofilms of Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis. Additionally, Hyp-HPβCD and/or DSPC/Hyp HPβCD modified implant material was examined in regard to its antibacterial efficacy. The surface coating containing only Hyp-HPβCD led to a reduction of 4.3 log10 of biofilm bacteria. This effect could be increased to a 6.8 log10 reduction by applying ultrasound. Chapter 7 investigates the antitumor characteristics of hypericin liposomes. Therefore, DRV liposomes consisting either of DPPC/TEL or DSPC were compared to vesicles of the same composition prepared using the thin film hydration method. The photodynamic in vitro activity on SK OV-3 cells was concentration dependent in case of all formulations. At a low irradiation fluence of 2.1 J/cm², the conventional liposomes were more phototoxic than the DRV liposomes. By increasing the irradiation fluence up to 12.4 J/cm², the phototoxicity of all formulations approached a similar level. Moreover, the photodynamic activity of the liposomes was dependent on the incubation time with an ideal incubation period of 4 h. Qualitative evidence for the uptake of liposomes into SK-OV-3 could be acquired from the CLSM micrographs. Endocytosis pathway studies led to the assumption that the DRV liposomes were mainly taken up by clathrin mediated endocytosis. Furthermore, the haemolysis assay and the aPTT time indicate that the liposomes were haemocompatible and thus suitable for intravenous injection. The photodynamic effect of the formulations on the microvasculature of the chorioallantoic membrane (CAM) is shown in Chapter 8. DRV liposomes exhibited only a moderate to no antivascular effect, while the conventional liposomes caused a substantial photodestruction of the microvasculature. These results indicate that the conventional liposomes are suitable for antivascular targeting by delivering hypericin to the endothelial cells. The DRV vesicles on the contrary seem to yield the Photosensitiser from light by a very stable encapsulation. Thus we assume that these vesicles can be further developed for direct tumour targeting.


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