Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel:The psychiatric risk gene Cacna1c regulates mitochondrial function in cellular stress responses
Autor:Michels, Susanne
Weitere Beteiligte: Culmsee, Carsten (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0075
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0075
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-00757
DDC: Pharmacology & therapeutics, prescription drugs
Titel(trans.):Das psychiatrische Risikogen Cacna1c reguliert die Mitochondrienfunktion bei zellulären Stressreaktionen

Dokument

Schlagwörter:
Gen-Umwelt Interaktionen, Oxidativer Stress, Cav1.2 Neuroinflammation Affective disorders Mitochondria Gene-environment interactions Oxidative stress, Mitochondrien, Cacna1c, Affektive Störungen

Summary:
Affective disorders such as major depression and bipolar disorder are among the most prevalent forms of mental illness, and their pathophysiology involves complex interactions between genetic and environmental risk factors. However, the underlying mechanisms explaining how genetic and environmental alterations affect the risk for psychiatric disorders are still largely unknown. Confirmed by several genome-wide association studies over the past ten years, CACNA1C represents one of the strongest and most replicable psychiatric risk genes. Besides genetic predispositions, environmental influences such as childhood maltreatment or chronic stress also contribute to disease vulnerability. In addition, increasing evidence suggests a crucial role for mitochondrial dysfunction, oxidative stress, excitotoxicity, and neuroinflammation in the development of major neuropsychiatric disorders. Furthermore, mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) is currently being discussed as a potential biomarker for affective disorders supporting early diagnosis, control of disease progression, and evaluation of treatment response. In a translational setting, the present project focused on the effects of defined gene-environment interactions on brain mitochondrial integrity and function in order to provide new insights into pathophysiological mechanisms of affective disorders and to identify novel therapeutic targets with potential relevance for future treatment strategies. Using immortalized mouse hippocampal HT22 cells, a well-established model system to investigate glutamate-mediated oxidative stress, it was demonstrated that both siRNA-mediated Cacna1c gene silencing and L-type calcium channel (LTCC) blockade with nimodipine significantly prevented the glutamate-mediated rise in lipid peroxidation, excessive ROS formation, collapse of mitochondrial membrane potential, loss of ATP, reduction in mitochondrial respiration, and ultimately neuronal cell death. Moreover, both Cacna1c knockdown and pharmacological LTCC inhibition altered CaV1.2-dependent gene transcription, thereby suppressing the glutamate-induced expression of the inner mitochondrial membrane calcium uptake protein MCU. Accordingly, downregulation of Cacna1c substantially diminished the elevation in mitochondrial calcium levels after glutamate treatment. In the employed paradigm of oxidative glutamate toxicity, Cacna1c depletion also protected against detrimental mitochondrial fission and stimulated mitochondrial biogenesis without affecting mitophagy, thus promoting the turnover of mitochondria and preventing the accumulation of dysfunctional mitochondria in neuronal HT22 cells. These data imply that upstream genetic modifications, e.g. reduced CACNA1C expression, converge to control mitochondrial function, resulting in cellular resilience against oxidative stress. In primary cortical rat neurons, heterozygous Cacna1c knockout partially reduced Cacna1c expression but had no impact on either initial increase in [Ca2+]i or delayed perturbations in mitochondrial bioenergetics, ATP levels, and cell viability in response to glutamate-mediated excitotoxicity. Furthermore, Cacna1c mRNA and protein expression levels were subject to strong regulation and degradation in this model of neuronal excitotoxicity. Partial neuroprotection against long-term glutamate toxicity by pharmacological LTCC blockade highlighted a potential dose-effect-dependency and the involvement of LTCCs in this cell death pathway. In primary rat microglia cultures, both Cacna1c haploinsufficiency and nimodipine treatment were associated with reduced morphological changes and glycolytic metabolism upon lipopolysaccharide (LPS) stimulation. The LPS-induced shift from oxidative phosphorylation towards glycolysis seems essential for the inflammatory response, since the downstream release of NO, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, and TNF-α was also decreased in heterozygous Cacna1c as well as nimodipine-treated microglial cells. These results indicate a major functional role for CaV1.2-dependent signaling in the pro-inflammatory activation of microglia, the innate immune cells of the central nervous system. By simulating the interaction of psychiatric disease-relevant genetic and environmental factors in vivo, the present study additionally evaluated their potential effect on brain mitochondrial function using a constitutive heterozygous Cacna1c rat model in combination with a four-week exposure to either post-weaning social isolation, standard housing, or social and physical environmental enrichment during the juvenile developmental period. In this specific gene-environment setting, isolated mitochondria from prefrontal cortex and hippocampus, both representing particularly susceptible brain regions in neuropsychiatric disorders, did not reveal considerable differences in mitochondrial bioenergetics, respiratory chain complex protein levels, superoxide formation, and membrane potential between the investigated conditions. Finally, mitochondrial function was investigated in human PBMCs from probands recruited in the Marburg/Münster Affective Disorders Cohort Study (MACS). However, neither a family history of psychiatric disorders nor an experience of maltreatment during childhood had a significant effect on mitochondrial superoxide levels and respiratory parameters in PBMCs from healthy female subjects. Consequently, further research is required in order to shed more light on the early pathological mechanisms underlying neuropsychiatric disorders. Overall, the present findings suggest that the GWAS-confirmed psychiatric risk gene CACNA1C plays a significant role in oxidative stress as well as neuroinflammatory pathways with particular impact on mitochondrial integrity and function, thereby adding to a better understanding of the intracellular processes likely involved in the pathophysiology of CACNA1C-associated disorders. Thus, modulating L-type calcium signaling may offer an effective therapeutic strategy in psychiatric disorders, where neuronal atrophy and inflammation contribute to disease pathophysiology.

Zusammenfassung:
Affektive Störungen wie schwere Depressionen und bipolare Störungen gehören zu den häufigsten Formen psychischer Erkrankungen. Ihre Pathophysiologie beruht auf komplexen Wechselwirkungen zwischen genetischen und umweltbedingten Risikofaktoren. Wie genetische und umweltbedingte Veränderungen das Risiko für psychiatrische Erkrankungen auf molekularer Ebene beeinflussen, ist jedoch noch weitgehend ungeklärt. Mehrere genomweite Assoziationsstudien (GWAS) der letzten zehn Jahre zeigen eindeutig, dass CACNA1C zu den bedeutendsten neuropsychiatrischen Risikogenen zählt. Neben genetischen Prädispositionen tragen auch Umwelteinflüsse wie Misshandlung in der Kindheit oder chronischer Stress zu einer erhöhten Krankheitsanfälligkeit bei. Darüber hinaus gibt es in letzter Zeit vermehrt Hinweise darauf, dass mitochondriale Dysfunktion, oxidativer Stress, Exzitotoxizität und Neuroinflammation bei der Entwicklung psychiatrischer Störungen eine entscheidende Rolle spielen. Zudem werden mitochondriale Funktionsstörungen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) derzeit als potentieller Biomarker für affektive Störungen diskutiert, die eine frühe Diagnose, eine Beurteilung des Krankheitsverlaufs und die Bewertung des Ansprechens auf eine Behandlung unterstützen sollen. Mit Hilfe eines translationalen Ansatzes, beschäftigte sich die vorliegende Arbeit mit den Auswirkungen definierter Gen-Umwelt-Interaktionen auf die Integrität und Funktion von Mitochondrien in Neuronen und Mikrogliazellen, um tiefere Einblicke in pathophysiologische Mechanismen affektiver Störungen zu gewinnen und neue therapeutische Zielstrukturen mit potentieller Relevanz für zukünftige Behandlungsstrategien zu identifizieren. In immortalisierten hippokampalen HT22 Mauszellen, einem etablierten Modellsystem zur Untersuchung von Glutamat-vermitteltem oxidativem Stress, konnten durch Cacna1c-Inhibition auf mitochondrialer wie auch auf zellulärer Ebene protektive Effekte aufgezeigt werden. Sowohl Cacna1c Knockdown als auch die Blockade von L-Typ-Calciumkanälen (LTCC) mit Nimodipin hemmten den Glutamat-induzierten Anstieg der Lipidperoxidation, die übermäßige Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), den Abfall des mitochondrialen Membranpotentials, den Verlust an ATP, die Verringerung der mitochondrialen Atmung und letztlich auch den neuronalen Zelltod. Darüber hinaus führten Cacna1c „Gen-Silencing“ sowie pharmakologische LTCC-Hemmung zu einer veränderten CaV1.2-abhängigen Regulation der Gentranskription, wodurch die Expression des mitochondrialen Calcium-Uniporters (MCU) nach Glutamatschädigung signifikant unterdrückt wurde. Dies führte in den Cacna1c-defizienten Zellen auch zu einem deutlich verminderten Calciumanstieg in den Mitochondrien nach Glutamatexposition. Im verwendeten Modell der oxidativen Glutamattoxizität schützte die siRNA-vermittelte Cacna1c Depletion auch vor mitochondrialer Fragmentierung und stimulierte die mitochondriale Biogenese, ohne sich auf die Mitophagie auszuwirken, wodurch der mitochondriale Umsatz gefördert und die Akkumulation dysfunktionaler Mitochondrien in neuronalen HT22-Zellen vermindert wurde. Dies deutet darauf hin, dass die Effekte vorgeschalteter genetischer Modifikationen, wie zum Beispiel einer reduzierten CACNA1C Expression, konvergieren und sich auf die mitochondrialen Funktionen auswirken, was zu einer erhöhten zellulären Resilienz gegen oxidativen Stress beiträgt. In primären kortikalen Rattenneuronen reduzierte der heterozygote Cacna1c Knockout die Proteinexpression auf etwa die Hälfte der Wildtyp-Level. Nach Glutamat-vermittelter Exzitotoxizität war jedoch weder ein Einfluss auf den initialen Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration noch auf die zeitverzögerten Störungen der mitochondrialen Bioenergetik, der ATP Spiegel oder der Zellviabilität nachzuweisen. Ferner unterlagen die Cacna1c mRNA- und Proteinexpressionsspiegel in diesem Modell der neuronalen Exzitotoxizität starken Regulations- und Abbaumechanismen. Dagegen unterstreicht die partielle Neuroprotektion gegen Glutamattoxizität durch pharmakologische LTCC-Blockade mit Dihydropyridinen eine mögliche Dosis-Wirkungs-Abhängigkeit und die Beteiligung von LTCCs im Glutamat-vermittelten exzitotoxischen Zelltod. In primären Mikroglia-Kulturen der Ratte waren Cacna1c Haploinsuffizienz sowie Nimodipin-Behandlung assoziiert mit reduzierten morphologischen Veränderungen und einer abgeschwächten glykolytischen Aktivität nach Lipopolysaccharid (LPS)-Stimulation. Darüber hinaus scheint die LPS-induzierte Verschiebung vom oxidativen Metabolismus hin zur Glykolyse für die weitere Entzündungsreaktion essenziell zu sein, da zusätzlich eine verminderte Freisetzung von NO, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10 und TNF-α sowohl in heterozygoten Cacna1c als auch in Nimodipin-behandelten Mikrogliazellen beobachtet wurde. Diese Ergebnisse weisen auf eine wichtige funktionelle Rolle CaV1.2-abhängiger Signalwege in der pro-inflammatorischen Aktivierung der Mikroglia als zellulärer Bestandteil der angeborenen Immunität im zentralen Nervensystem hin. Durch die Simulation krankheitsrelevanter Interaktionen genetischer und umweltbedingter Faktoren im Tiermodell wurden in dieser Studie zudem ihre potentiellen Effekte auf die Funktion zerebraler Mitochondrien evaluiert. Dies wurde mithilfe konstitutiv heterozygoter Cacna1c Ratten realisiert, welche während der juvenilen Entwicklungsphase für vier Wochen entweder in sozialer Isolation, unter Standardbedingungen oder in sozial und materiell angereicherter Umgebung gehalten wurden. Allerdings zeigten isolierte Mitochondrien sowohl aus dem präfrontalen Cortex als auch aus dem Hippocampus keine wesentlichen Unterschiede zwischen den untersuchten Gen-Umwelt Kohorten im Hinblick auf die mitochondriale Bioenergetik, die Proteinkomplexe der Atmungskette, die Superoxidproduktion und das Membranpotential. In einem weiteren Teil dieser Studie wurde an humanen PBMCs aus der MACS (Marburg/Münster Affective Disorders Cohort Study) Kohorte gezeigt, dass weder eine familiäre Vorgeschichte psychischer Störungen noch die Erfahrung von Misshandlung in der Kindheit einen signifikanten Effekt auf mitochondriale ROS Level und Parameter der mitochondrialen Respiration in PBMCs gesunder weiblicher Probanden hatte. Hierzu sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die frühen pathologischen Mechanismen besser zu verstehen, die neuropsychiatrischen Erkrankungen zugrunde liegen. Insgesamt deuten die vorliegenden Forschungsergebnisse darauf hin, dass das durch GWAS ermittelte psychiatrische Risikogen CACNA1C eine zentrale Rolle in der Regulation mitochondrialer Integrität und Funktion spielt und so auch neuroinflammatorische Signalwege und die Resilienz gegen oxidativen Stress beeinflusst. Diese Arbeit trägt damit zu einem besseren Verständnis der intrazellulären Prozesse bei, die vermutlich an der Pathophysiologie von CACNA1C-assoziierten Erkrankungen beteiligt sind. Die Modulation zerebraler LTCC könnte somit eine therapeutische Option bei psychiatrischen Störungen darstellen, die sowohl durch neuronale Atrophie als auch durch Entzündungsprozesse gekennzeichnet sind.


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