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Titel:Localization and biochemical characterization of the small secreted protein Dld1 from the root endophytic fungus Piriformospora indica
Autor:Nostadt, Robin
Weitere Beteiligte: Zuccaro, Alga (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0059
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0059
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-00596
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Lokalisierung und biochemische Charakterisierung des kleinen sekretierten Proteins Dld1 vom Wurzelendophyten Piriformospora indica

Dokument

Schlagwörter:
Symbiose, Hordeum vulgare, Cell Wall Appositions, Wurzelsymbiose, Gerste, Barley, Zellwandappositionen, Hordeum vulgare, Papillae, Piriformospora indica, Piriformospora indica, Dld1, Papillae, Dld1, Molekularbiologie, Gerste, Root symbiosis, Wurzel, Biochemie

Summary:
P. indica is a symbiont with a biphasic colonization strategy. It colonizes the roots of a broad range of plant species, including the monocot plant H. vulgare (barley) where it has a variety of beneficial effects. The interaction is marked by characteristics of the plant innate immune response, including the localized production of reactive oxygen species (ROS) and formation of cell wall appositions (CWA). In barley, the colonization is furthermore accompanied by a localized accumulation of reactive Fe3+ in CWAs, which in turn mediates the production of ROS. In the plant immune response, ROS, among other functions, are responsible for the fortification and maturation of CWAs by polymerization of ferulic acid and crosslinking of defensive proteins and phenolic compounds with cell wall polymers. During the early stages of P. indica / barley interaction, when the fungus tries to penetrate the wall of root cells, resulting in the formation of CWAs, the expression of P. indica gene DLD1 is upregulated. The encoded protein Dld1, belongs to a family of small secreted proteins unique to P. indica, which exhibit a large number of regularly distributed histidine and alanine residues, as well as a conserved motif with the consensus sequence RSIDELD located at the C-terminus. In this study, the localization of Dld1, as well as its biophysical and biochemical characteristics were investigated. Although the secretion of Dld1 by P. indica remains unclear, it was demonstrated that Dld1 is secreted by Ustilago maydis Dld1-expression strains both in vitro and in planta, and during transient expression in barley. In this host, Dld1 co-localizes with Fe3+ in CWAs, formed in response to fungal infection. Dld1 was heterologously produced in E. coli. The purified protein was used for circular dichroism spectroscopy and protein x-ray crystallography in cooperation with the group of Prof. Lupas, Tübingen. The crystal structure demonstrates that Dld1 adapts a coiled-coil structure with two antiparallel helices. Its folding was shown to be pH-sensitive. While the histidines protrude from the face of the two helices and interdigitate like teeth of a zipper, alanines occupy most of the helix-inward positions to facilitate a very tight structural assembly, previously termed alacoil. In qualitative and quantitative metal ion binding assays, Dld1 bound several metal ions. The dissociation constants for the binding of Fe3+ and Zn2+ were determined in the low micromolar range. Originally, a function for Dld1 as metal ion scavenger was postulated, but the protein is unable to prevent the Fe3+-catalyzed oxidation of the chemical substrate diaminobenzidine. Instead, Dld1 interferes with the radical-induced polymerization of diaminobenzidine. This observation indicates that Dld1 might interfere with analogous reactions at the plant cell wall, e.g. the polymerization of ferulic acid in maturing CWAs. This might contribute to the ability of P. indica to overcome barley CWAs in order to establish a compatible interaction.

Zusammenfassung:
Piriformospora indica ist ein Symbiont mit einer biphasischen Kolonisierungsstrategie. Er kolonisiert ein breites Spektrum von Wirtspflanzen, inklusive der monokotyledonen Pflanze Hordeum vulgare (Gerste), in der er eine Vielzahl von nützlichen Effekten bewirkt. Die Interaktion weißt Charakteristika der pflanzlichen Immunantwort auf, einschließlich der lokalisierten Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species; ROS) und der Bildung von Zellwandappositionen (engl. cell wall apposition(s); CWA). Ferner wird die Kolonisierung von Gerste durch die Anreicherung von reaktivem Fe3+ in CWAs begleitet, die wiederum die Produktion von ROS vermitteln. In der pflanzlichen Immunantwort sind ROS unter anderem für die Festigung und den Ausbau von CWAs durch die Polymerisierung von Ferulasäure und die chemische Quervernetzung von Abwehrproteinen und phenolischen Verbindungen mit Zellwandpolymeren verantwortlich. In den frühen Stadien der P. indica / Gerste Interaktion, wenn der Pilz versucht die pflanzliche Zellwand zu durchstoßen, was zu Bildung von CWAs führt, wird die Expression des P. indica Gens PIIN_05872 (nachfolgend als DLD1 bezeichnet) hochreguliert. Das kodierte Protein Dld1 gehört zu einer P. indica-spezifischen Proteinfamilie, welche sich durch eine Vielzahl von regelmäßig verteilten Histidinen und Alaninen, sowie einem C-terminal lokalisieren Motiv mit der Konsensussequenz RSIDELD auszeichnet. In dieser Arbeit wurden die Lokalisierung, sowie die biophysikalischen und biochemischen Charakteristika von Dld1 untersucht. Obwohl die Sekretion von Dld1 durch P. indica unklar bleibt, konnte gezeigt werden, dass Dld1 sowohl von Ustilago maydis Dld1-Expressionsstämmen in vitro und in planta, als auch während transienter Expression in Gerstenzellen, sekretiert wird. In Gerste zeigt Dld1 eine Kolokalisation mit Fe3+ in CWAs, die als Antwort auf eine Pilzinfektion gebildet werden. Dld1 wurde heterolog in Escherichia coli produziert. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Lupas aus Tübingen wurde das gereinigte Protein für CD-Spektroskopie und Protein-Röntgen-Kristallstrukturanalyse verwendet. Die Kristallstruktur zeigt, dass Dld1 eine Coiled-coil Struktur aus zwei antiparallelen Alpha-Helices einnimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die Struktur pH-sensitiv ist. Während die Histidine auf einer Seite der Helix hervorstehen und wie die Zähne eines Reißverschlusses ineinandergreifen, nehmen die Alanine die meisten Positionen auf der Helix-Innenseite ein, um eine räumlich enge Struktur zu ermöglichen, die in der Vergangenheit als Alacoil benannt wurde. Mit qualitativen und quantitativen Metallbindeassays konnte gezeigt werden, dass Dld1 verschiedene Metallionen binden kann. Die Dissoziationskonstanten für eine Bindung von Fe3+ und Zn2+ konnten im niedrigen mikromolaren Bereich bestimmt werden. Ursprünglich wurde für Dld1 eine Funktion als Metall-Scavenger vermutet, aber Dld1 kann eine Fe3+-katalysierte Oxidation des chemischen Substrats Diaminobenzidin nicht verhindern. Stattdessen, inhibiert Dld1 die Radikal-induzierte Polymerisation von Diaminobenzidin. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass Dld1 analoge Reaktionen an der pflanzlichen Zellwand verhindern könnte, z.B. die Polymerisierung von Ferulasäure. Dies könnte schlussendlich dazu beitragen, dass P. indica fähig ist die von Gerste gebildeten CWAs zu überwinden, um eine kompatible Interaktion zu etablieren.


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