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Titel:Untersuchungen zur Bildung von Hydroxyzimtsäureestern in Ocimum basilicum, Cichorium intybus und Actaea racemosa
Autor:Werner, Victoria
Weitere Beteiligte: Petersen, Maike (Prof.Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0053
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-00536
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0053
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.):Investigations on the formation of hydroxycinnamic acid esters in Ocimum basilicum, Cichorium intybus and Actaea racemosa

Dokument

Schlagwörter:
Cichorium intybus, BAHD-A, Hydroxycinnamoyltransferase, Ocimum basilicum, Actaea racemosa, Cimicifuga racemosa, Zichoriensäure, Cimicifugasäure

Zusammenfassung:
Eine wichtige Gruppe pflanzlicher Inhaltsstoffe sind phenolische Verbindungen, zu denen Hydroxyzimtsäureester wie Rosmarinsäure, Chlorogensäure, aber auch Zichoriensäure und die Cimicifugasäuren zählen. Die Biosynthese dieser Hydroxyzimtsäureester wird durch Hydroxycinnamoyltransferasen aus der BAHD-Superfamilie katalysiert. Zichoriensäure wurde zuerst in der Zichorie, Cichorium intybus L. (Asteraceae), entdeckt. Es handelt sich um Dicaffeoylweinsäure. Bisherige Untersuchungen mit Proteinrohextrakten aus Ackerschachtelhalm (Equisetum arvense L., Equisetaceae) und einer Erdnuss-Art (Arachis glabrata L., Fabaceae) zeigten, dass die Bildung der Zichoriensäure durch Reaktion von Weinsäure mit Caffeoyl-CoA zunächst zur Bildung von Kaftarsäure führt, die dann durch Anlagerung einer weiteren Kaffeesäure zu Zichoriensäure umgesetzt wird. Das daran beteiligte Enzym konnte jedoch noch nicht isoliert werden. Auch Basilikum (Ocimum basilicum L., Lamiaceae) enthält, neben Rosmarinsäure, Zichoriensäure. Die in dieser Arbeit untersuchten Proteinrohextrakte führten unter Verwendung von m-, L- und D-Weinsäure mit Caffeoyl-CoA zu keiner Bildung von Zichoriensäure. Die von uns angelegten Zellkulturen enthielten Rosmarin-säure, jedoch keine nachweisbare Menge Zichoriensäure. Eine Elicitierung über bis zu 96 h mit 100 µM Methyljasmonat führte nicht zur Bildung von Zichoriensäure, jedoch stieg der Rosmarinsäuregehalt von anfangs 2,6 % auf 5,3 % im Trockengewicht. Eine Zufütterung von Weinsäure zu den Suspensionskulturen des Basilikums konnte die Zichoriensäure-Biosynthese nicht induzieren. Untersuchungen von Zellkulturen der Zichorie zeigten ebenfalls kein Vorhandensein der Zichoriensäure. Weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet sind nötig, da die Biosynthese der Zichoriensäure und die beteiligten Enzyme noch immer nicht bekannt sind. Cimicifugasäuren erhielten ihren Namen von Cimicifuga racemosa (L.) NUTT., heute Actaea racemosa L., der Traubensilberkerze. Diese mehrjährige, ein ausgeprägtes Rhizom ausbildende Art der Ranunculaceae findet Verwendung in der Therapie von peri- und postmenopausalen Beschwerden. Die biologische Wirkung und die Biosynthese der Inhaltsstoffe der Traubensilberkerze sind bisher nicht aufgeklärt. Eine bis dato nicht charakterisierte Nukleotidsequenz aus der Traubensilberkerze, welche eine hohe Sequenzähnlichkeit zu anderen Enzymen der BAHD-Enzymfamilie aufweist, konnte erfolgreich amplifiziert (ArCAS) und in E. coli-Zellen exprimiert werden. Das aufgereinigte Protein hat eine Größe von 50 kDa. Zur Testung auf Aktivität wurden zunächst die erforderlichen (Hydroxy)Cinnamoyl-CoA-Ester synthetisiert und Piscidinsäure aus einem Extrakt aus Quillaja saponaria isoliert. Tests des Enzyms mit Piscidinsäure und p-Cumaroyl-, Caffeoyl-, Sinapoyl- und Feruloyl-CoA führten zur Bildung der entsprechenden Cimicifugasäuren. Die Charakterisierung des Enzyms unter vorher bestimmten optimalen Bedingungen zeigte, dass p Cumaroyl CoA mit einem Km-Wert von 6,8 ± 2,3 µM das am besten akzeptierte Substrat ist. Ein reverser Enzymtest mit Fukinolsäure und Coenzym A als Substraten zeigt die Bildung von Fukinsäure. Dies ist ein erster Hinweis auf die Akzeptanz der Fukinsäure durch die ArCAS, da Fukinsäure für Tests nicht zur Verfügung stand. Das Anlegen von Zellkulturen aus Frischmaterial und Samen der Traubensilberkerze war bisher nicht erfolgreich, doch stellen Zellkulturen eine wichtige Grundlage für weitere Untersuchungen der Expression der ArCAS dar. Zudem ist die Biosynthese der Piscidin- und Fukinsäure bislang nicht untersucht, so dass auch in diesem Fall die Zellkulturen verwendet werden könnten. Eine phylogenetische Untersuchung ergab eine Verwandtschaft der ArCAS mit einer Spermidin Hydroxycinnamoyltransferase aus Malus domestica Borkh., einer Äpfelsäure Hydroxycinnamoyltransferase aus Trifolium pratense L. und einer Tetrahydroxyhexandisäure Hydroxycinnamoyltransferase aus Phaseolus vulgaris L.. Trotz dieser phylogenetischen Nähe wurde keines der Substrate dieser Enzyme durch die ArCAS akzeptiert. Auch die Substrate anderer Hydroxycinnamoyltransferasen wie p-Hydroxyphenylmilchsäure, Chinasäure, Shikimisäure und verschiedene Aminosäuren wurden getestet, jedoch nicht durch das Enzym akzeptiert. Daraus lässt sich ableiten, dass ArCAS eine hohe Spezifität für die Bildung von Cimicifugasäuren hat. Blüten, Blätter und Wurzeln von Actaea racemosa wurden extrahiert und der Gehalt an Polyphenolen mittels Folin-Ciocalteu-Reagenz bestimmt. Den höchsten Gehalt an Polyphenolen wiesen die Blätter auf, den niedrigsten hingegen die Wurzeln. Weitere Untersuchungen der Extrakte zeigten, dass die Mengen an Cimicifugasäuren variieren. Ebenso unterscheidet sich die Verteilung der Cimicifugasäuren innerhalb der Pflanze, überdies sind nicht alle der bekannten Cimicifugasäuren nachweisbar. Die ArCAS ist das Hauptenzym der Cimicifugasäure-Biosynthese aus CoA-aktivierten Hydroxyzimtsäuren und Piscidinsäure. Durch die hier präsentierten Untersuchungen ist erstmalig ein Schritt der Bildung von Cimicifugasäuren in Actaea racemosa aufgeklärt worden.

Summary:
An important group of plant compounds are phenolics, especially hydroxycinnamic acid esters like rosmarinic acid, chlorogenic acid, but also chicoric acid and cimicifugic acids. Most of these hydroxycinnamic acid esters are synthesised by BAHD-type hydroxycinnamoyltransferases. Chicoric acid, dicaffeoyltartaric acid, was first isolated from Cichorium intybus L. (Asteraceae). The formation of chicoric acid is a two-step reaction. Caffeiic acid is transferred from caffeoyl-CoA to tartaric acid to form caftaric acid, a further addition of caffeic acid leads to chicoric acid. This was observed in crude protein extracts from Equisetum arvense L. (Equisetaceae) and Arachis glabrata L. (Fabaceae). The main enzyme of this reaction was not isolated yet. The common basil (Ocimum basilicum L., Lamiaceae) contains, amongst others, rosmarinic and chicoric acids. In this thesis, crude protein extracts of basil cell cultures were used to investigate the formation of chicoric acid. For the enzyme assays m-, L-, as well as D-tartaric acid were used with caffeoyl-CoA as donor substrate. None of these assays showed a formation of chicoric acid. There was even no chicoric acid present in cell cultures we established although rosmarinic acid could be found. Elicitation of the cell cultures up to 96 h with 100 µM methyl jasmonate resulted in an increase of rosmarinic acid content from 2.6 % to 5.3 % of cell dry weight. However, the biosynthesis of chicoric acid was not induced. Supplementary feeding of tartaric acid to the cell cultures could not induce the biosynthesis of chicoric acid. Furthermore, investigations on cell cultures of Cichorium intybus revealed the absence of chicoric acid. Further research is necessary because the involved enzymes of chicoric acid biosynthesis are still unknown. Cimicifugic acids got the name from Cimicifuga racemosa (L.) NUTT., nowadays Actaea racemosa L.. This perennial plant from the family Ranunculaceae forms a distinct rhizome. Black cohosh is used against peri- and postmenopausal afflictions. Nevertheless, the biological effect and the biosynthesis of cimicifugic acids are not elucidated yet. An uncharacterised nucleotide sequence from Actaea racemosa with a high sequence similarity to enzymes from BAHD-superfamily was amplified (ArCAS) and expressed in E. coli cells. The encoded protein has a molecular mass of 50 kDa. Different hydroxycinnamoyl-CoA esters have been synthesised and piscidic acid was isolated from Quillaja saponaria extracts. Assays with p-coumaroyl-, caffeoyl-, sinapoyl- and feruloyl-CoA as acceptor substrates lead on to the formation of the respective cimicifugic acids. Optimal conditions for the enzyme assays were determined and kinetic assays were performed. The best accepted substrate was p-coumaroyl-CoA with a Km-value of 6.8 ± 2.3 µM. A reverse enzyme assay, using fukinolic acid and coenzyme A as substrates, showed the formation of fukiic acid by the enzyme. The isolation of fukiic acid was not possible, until now, so this result is a first evidence that fukiic acid is a substrate of ArCAS. The establishment of plant cell cultures from fresh plant material as well as seeds was not successful. Cell cultures would be important for expression analysis and further investigations on the biosynthesis of piscidic and fukiic acid. Investigations on the phylogenetic relationship of ArCAS with other BAHD-hydroxy-cinnamoyltransferases showed a close relationship to a spermidine hydroxycinnamoyltransferase from Malus domestica, as well as a malate hydroxycinnamoyltransferase from Trifolium pratense and a tetrahydroxyhexanedioic acid hydroxycinnamoyltransferase from Phaseolus vulgaris. However, ArCAS did not accept the substrates of these enzymes. Also substrates from other hydroxycinnamoyltransferase like p-hydroxyphenyllactic acid, quinic acid, shikimic acid or amino acids showed no product formation. ArCAS therefore has a high specificity for the formation of cimicifugic acids. Flowers, leaves and roots of Actaea racemosa were extracted and the total phenolic content determined using Folin-Ciocalteu reagent. The highest content could be found in leaves whereas the lowest was in the roots. Further investigations on these extracts revealed different distribution patterns of cimicifugic acids as well as different amounts of these acids in the different parts of the plant. ArCAS is the main enzyme for the biosynthesis of cimicifugic acid from (hydroxy)cinnamoyl-CoA esters and piscidic acid. The investigations presented in this thesis are a first step to elucidate the biosynthesis of cimicifugic acids in Actaea racemosa.


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