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Titel:Entwicklung eines standardisierbaren Systems zum quantitativen Nachweis von DNAzym-Aktivität in vitro für den Einsatz in der Therapie des allergischen Asthma bronchiale
Autor:Casola, Lisa Maria
Weitere Beteiligte: Garn, Holger (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0029
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-00296
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0029
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Development of a standardizable test system for quantitative detection of DNAzyme activity in vitro to use in therapy of allergic asthma

Dokument

Schlagwörter:
Allergisches Asthma, GATA-3, GATA-3, Allergisches Asthma, DNAzym, Reportergensystem, reporter gene system, Antisense Strategien, DNAzyme, Reportergensystem, DNAzym, GATA-3, antisense strategies, Allergic asthma, Antisense Strategien

Zusammenfassung:
Allergisches Asthma bronchiale gehört zu den häufigsten chronisch-entzündlichen Erkrankungen in den industrialisierten Ländern. Die Betroffenen leiden unter einer Hyperreagibilität des Bronchialssytems, rezidivierender bronchialer Obstruktion und Entzündung und schließlich einem sogenannten “Airway Remodelling” mit irreversiblen strukturellen Veränderungen. Die Genese der Erkrankung ist multifaktoriell. Pathophysiologisch führt der Kontakt mit Allergenen zu einer Kaskade des Immunsystems, an deren Ende die Degranulation von Mastzellen mit massiver Freisetzung der Substanzen steht, welche die typische allergische Reaktion hervorrufen. Bei diesem Vorgang spielt ein Ungleichgewicht der T-Helferzellen mit Verschiebung zugunsten der Th2-Subpopulation eine entscheidende Rolle. Die Differenzierung in diese Richtung wird wesentlich durch den Transkriptionsfaktor GATA-3 vermittelt. Bisher ist eine Therapie des allergischen Asthma bronchiale nur symptomatisch (z.B. mittels β2-Sympathomimetika oder Glukokortikoiden) möglich. Nicht nur aufgrund der teilweise signifikanten Nebenwirkungen dieser Substanzen besteht ein „medical need“ für kausale Therapieansätze. Diese aktuell noch bestehende Lücke könnte durch Antisense-Strategien ausgefüllt werden, die über eine Interferenz mit der mRNA eine anschließende Translation und damit Proteinüberexpression unterbinden sollen. DNAzyme beispielsweise binden an mRNA, um sie mittels inhärenter katalytischer Aktivität zu degradieren. Zum Zeitpunkt der experimentellen Phase dieser Dissertation existierte kein einfaches in vitro-Testsystem, mit dem man eine verlässliche Aussage zur Effizienz einzelner DNAzyme treffen kann. Entsprechend sollten in der vorliegenden Arbeit zwei Testsysteme generiert und hinsichtlich ihrer Praxistauglichkeit verglichen werden. In beiden Fällen wurde als Modellsystem das DNAzym hgd40 verwendet, das in der Lage ist, die mRNA des Transkriptionsfaktors GATA-3 zu spalten. Dessen genetische Sequenz wurde zum einen in einen Vektor einkloniert, der zudem den Genabschnitt eines fluoreszierenden Proteins (mCherry) enthält. Zum anderen fand ein Reportergensystem Anwendung, das Genabschnitte für Luciferasen beinhaltet (Vektor psiCheck mit den Luciferasen Firefly und Renilla). Die Degradierung der GATA-3 mRNA durch hgd40 sollte eine Reduktion der Proteinexpression von mCherry und den Luciferasen bewirken, sodass über eine entsprechend verminderte Signaldetektion die Effizienz des DNAzyms messbar gemacht werden kann. Letztendlich gelang es, entsprechende Expressionsvektoren zu konstruieren und mittels Transfektion in Zellen (HEK-293) einzubringen. Auch konnte eine erfolgreiche Transfektion der Zellen mit dem DNAzym gezeigt werden. Allerdings war nach Behandlung mit hgd40 keine Suppression des jeweiligen Signals messbar. Die Gründe hierfür können vielfältig sein. Zunächst ist die Wahl der Zelllinie und des Transfektionsreagenz von großer Bedeutung, da Probleme beim Einbringen des DNAzyms in die Zellen oder der intrazellulären Freisetzung in passende Kompartimente auftreten können. Zudem spielt die Struktur der Ziel-mRNA eine entscheidende Rolle für eine erfolgreiche Interaktion. Auch kann die Expression der Zielstruktur durch intrazelluläre Faktoren oder Umwelteinflüsse behindert werden und es kann zu Hindernissen bei der Signaldetektion kommen. Zur Vermeidung der genannten Probleme wurden verschiedene Transfektionsprotokolle und Nachweismethoden ausgetestet. Es wurde deutlich, dass jeder Schritt zur Erstellung eines derartigen Testsystems für DNAzyme komplikationsbehaftet ist und es weiterführender Untersuchungen bedarf. Auch wenn in keinem der beiden vorgestellten Ansätze eine Regulation durch das DNAzym gezeigt werden konnte, so waren bezüglich des Systems psiCheck-GATA-3 zumindest eine ausreichende Expression der Luciferasen und GATA-3 sowie eine intrazelluläre Aufnahme des DNAzyms nachweisbar. Insgesamt scheint dieses System demnach für nachfolgende Untersuchungen geeigneter.

Summary:
Allergic asthma is one of the most common chronic-inflammatory diseases in industralized countries. Patients suffer from a hyperreactivity, recurrent bronchial obstruction and inflammation; and finally so-called “airway remodelling”, which represents irreversible structural changes. Genesis of the disease is multifactorial. In its pathophysiology, contact with allergens leads the initiation a cascade of immunological events. Downstream this causes the degranulation of mast cells with massive liberation of preformed substances that arouse the typical allergic symptoms. During this process, a misbalance in the equilibrium of different T-helper-cell subtypes with a shift towards the subpopulation of Th2-cells plays a crucial role. The differentiation into this direction is essentially mediated by the transcription factor GATA-3. To date, allergic asthma may only be treated symptomatically, for example using ß2-mimetics or glucocorticosteroids. Thus, there is a significant medical need for causative therapeutic approaches, which is further underlined by unwanted side effects of current therapy options. In this matter, antisense strategies might be an approach to fill the still existing gap. They can inhibit translation and subsequent protein overexpression via interference with mRNA. DNAzymes, for example, bind mRNA and later degrade it by their inheritant catalytic activity. Unfortunately, so far no simple in vitro test system is available to make a reliable statement about the efficiency of individual DNAzymes. This dissertation aimed to develop two test systems and compare them concerning their suitability for daily use in research. In both cases, the transcription factor GATA-3 was chosen as a target for the DNAzyme hgd40 as model system. In one experimental setting, its genetic sequence was cloned into a vector, which additionally contains the gene locus for a fluorescent protein (mCherry). In the second approach, a reporter gene system was used, which included sequences for luciferases (vector psiCheck with the luciferases Firefly and Renilla). Degradation of the GATA-3 mRNA by hgd40 should cause a reduction of the expression of Cherry or the luciferases respectively, so that the reduced signal detection should demonstrate the efficacy of the DNAzyme. Finally, it was possible to create the appropriate expression vectors and transfer them into cells (HEK-293) via transfection. At the same time, a successful transfection of the cells with the DNAzyme could be shown. However, after treatment with hgd40 there was no measurable suppression of the signal. The reasons for this failure might be multiplex. First of all, the choice of the cell line and transfection medium is very important, because problems may occur at the point of uptake or liberation of the DNAzyme in the adequate compartment of the cell. Furthermore, the structure of the target mRNA plays a crucial role for a successful interaction. In addition, the expression of the target structure can be prohibited by intracellular or environmental factors as well as obstacles can arise during signal detection. To avoide aforementioned problems different assay protocols were tested. It becomes apparent that every step to create such a test system for DNAzymes is afflicted with complications, and that there is a clear need for further experiments. Both test systems did not show any target down-regulation after treatment with the DNAzyme. However, sufficient expression of the luciferases and GATA-3 as well as an intracellular uptake of the DNAzyme was detectable in the system working with the psiCheck-GATA-3 vector. Therefore, this test system seems to be more suitable for further studies.


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