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Titel:Entwicklung von DNAzymen gegen Humane Rhinoviren: Design und in vitro Testung
Autor:Unger, Sebastian
Weitere Beteiligte: Renz, Harald (Prof. Dr. med.)
Erscheinungsjahr:2019
URI:http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2019/0011
DOI: https://doi.org/10.17192/z2019.0011
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2019-00111
DDC:610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.):Development of DNAzymes against Human Rhinoviruses: Design and in vitro testing

Dokument

Schlagwörter:
Asthma bronchiale, Rhinoviren, DNAzyme, Antisense-Moleküle

Zusammenfassung:
Asthma bronchiale ist ein heterogenes Krankheitsbild aus wiederkehrender Ob-struktion der unteren Atemwege, bedingt durch Hyperreagibilität der Atemwegs-muskulatur, Hypersekretion und entzündlicher Ödembildung in der Schleimhaut, das weltweit über 300 Millionen Menschen betrifft. Oft beginnt die Krankheit in jungen Jahren und betrifft als chronisches Leiden ohne kurative Therapie alle Al¬tersgruppen. Die exakten Mechanismen und Gründe der Entstehung sind seit vie¬len Jahren Thema der Forschung, wobei das Zusammenspiel aus genetischer Disposition und Umwelteinflüssen als wichtigste Faktoren gesichert ist. Mit kon¬stant hohen Erkrankungsraten in den industrialisierten Nationen und steigenden Prävalenzen in den Entwicklungsländern geht Asthma mit hohen Kosten für die Gesundheitssysteme weltweit einher. Hohe Anteile der Kosten und der Belastung für die betroffenen Patienten gehen zurück auf Asthmaexazerbationen, mit ein¬hergehendem Bedarf für Notfall-Behandlungen und Krankenhauseinweisungen, am häufigsten ausgelöst durch die Infektion mit humanen Rhinoviren. Gegen diese Erreger der banalen Erkältung existiert bisher keine etablierte Therapie. Mit ihrem Genom aus einem positiven Einzelstrang-RNA-Molekül bieten sie ein mögliches Ziel für Antisense-Moleküle, speziell für DNAzyme, welche in den letzten Jahren vermehrt erfolgreich in der Forschung und in klinischen Stu¬dien eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurden DNAzyme gegen Abschnitte in¬nerhalb der 5`-untranslatierten Region und des CRE-Elements von drei repräsen¬tativen Testviren entwickelt und auf in vitro Aktivität geprüft. Die Moleküle wa¬ren in der Lage, die virale RNA spezifisch zu schneiden. Mittels Erstellung einer in silico Datenbank war es in einem zweiten Schritt möglich, die restlichen nicht unmittelbar getesteten Virustypen auf das Vorkommen der gefundenen Schnitt¬stellen zu überprüfen. Hier offenbarte sich das Problem von stark aktiven DNAzymen für einzelne Virustypen ohne breite Abdeckung der Gesamtheit ei¬nerseits, und DNAzymen mit breiter Abdeckung fast aller Virustypen aber gerin¬ger Aktivität andererseits. Als Ursache für die unterschiedliche Aktivität konnte die Sekundärstruktur des Virusgenoms identifiziert und im nächsten Schritt durch Modifikation der DNAzym-Bindungsdomä¬nenlänge die Abdeckung der verschiedenen Virustypen und die Spaltungsaktivität optimiert werden. So ist es gelungen vielversprechende DNAzyme zu selektieren, die in der Lage sind, mit ausgezeichneter Spaltungsaktivität über 98 Prozent der bekannten Virustypisolate anzugreifen. Diese Moleküle können nun in weiteren Experimenten in vivo eingesetzt und ge¬testet werden, um in Zukunft ein gezieltes Mittel gegen Erkältungsviren und durch sie hervorgerufene Asthmaexazerbationen zu ermöglichen.

Summary:
Asthma is a heterogeneous syndrome of recurrent obstruction in the lower airways caused by hyperreactivity of the airway muscles, hypersecretion and in¬flammatory edema in the mucous membrane, which affects over 300 million pe¬ople worldwide. The disease often starts at a young age and affects all age groups as a chronic disease without curative therapy. The exact mechanisms and reasons for development have been the subject of research for many years and have as¬sured the interaction of genetic disposition and environmental influences as the most important factors. With constantly high disease rates in industrialized na¬tions and increasing prevalence in developing countries, asthma is associated with high costs for healthcare systems worldwide. High proportions of costs and burden for the affected patients are due to asthma exacerbations, with associated need for emergency treatment and hospital admissions, most often triggered by infection with human rhinoviruses. So far there is no established therapy against these pathogens of the common cold. With their genome consisting of a positive single strand RNA molecule, they offer a potential target for antisense molecules, in particular for DNA enzymes, which have increasingly been used successfully in research and clinical studies in recent years. In this work, DNA enzymes were developed against sections within the 5`-untranslated region and the CRE element of three representative viruses and tested for in vitro activity. The molecules were able to specifically cleave the viral RNA. By creating an in silico database it was in a second step possible to check the remaining, not directly tested virus types for the presence of the found cleavage sites. This revealed the problem of highly active DNA enzymes for individual virus types without broad coverage of the whole on the one hand, and DNA enzymes with broad coverage of almost all virus types but low activity on the other. The secondary structure of the virus genome was identified as the cause for dif¬fering activity and coverage between virus types. In a next step the cleavage ac¬tivity could be optimised by modifying the DNA enzyme binding domain length. Likewise, it has been possible to select promising DNA enzymes that are able to attack over 98 percent of known virus type isolates with excellent cleavage acti¬vity. These molecules can now be used and tested in further in vivo experiments to provide a targeted cure for cold viruses and the asthma exacerbations they cause.


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