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| Titel: | Applications of Fungal Prenyltransferases in the Chemoenzymatic Synthesis |
| Autor: | Zhou, Kang |
| Weitere Beteiligte: | Li, Shu-Ming (Prof. Dr.) |
| Veröffentlicht: | 2017 |
| URI: | https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2017/0238 |
| URN: | urn:nbn:de:hebis:04-z2017-02388 |
| DOI: | https://doi.org/10.17192/z2017.0238 |
| DDC: | 615 Pharmacology & therapeutics, prescription drugs |
| Titel(trans.): | Anwendungen von pilzlichen Prenyltransferasen in der Chemoenzymatischen Synthese |
| Publikationsdatum: | 2017-05-24 |
| Lizenz: | https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/ |
| Schlagwörter: |
|---|
| Prenyltransferase, Prenyltransferase |
Summary:
Plants, bacteria, and fungi provide diverse structures derived from their primary and the secondary metabolism. Representative substances from secondary metabolite pathways are flavonoids, coumarins, xanthones, and indole alkaloids. The attachment of isoprene units (n × C5) such as dimethylallyl (DMAPP), geranyl (GPP), or farnesyl (FPP) moieties to the backbones of aromatic secondary metabolites is a further step for the broad diversification. Prenylated natural products often exhibit stronger pharmacological activities than their non-prenylated precursors. The prenyltransferases (PTs) accomplish these prenyl transfer reactions in nature. Therefore, the investigation on the applications of prenyltransferases could be used for structural modification of aromatic substances to produce biologically active compounds. Prenylated acylphloroglucinols (APs), which have remarkable chemical structures and intriguing biological and pharmacological activities, are characteristic constituents of several plant families. Main structural features of prenylated APs are highly oxygenated and densely decorated with prenyl moieties, such as dimethylallyl and geranyl moieties. Phlorisobutyrophenone (PIBP), phlorisovalerophenone (PIVP), and phlorbenzophenone (PBZP) serve as precursors of most prenylated APs. In the first part of this thesis, the acceptance of APs catalyzed by thirteen fungal prenyltransferases in the presence of DMAPP was elucidated. Nine regular prenylated products were obtained from the reactions with AnaPT. The results indicated that AnaPT catalyzes the same prenylation of PIBP and PIVP as the membrane-bound prenyltransferases like HIPT-1 involved in the biosynthesis of the prenylated APs in plants, but with much higher conversion yields than HIPT-1. However, only monoprenylated derivatives were obtained in the presence of DMAPP and the conversion yields of PIBP, PIVP, and PBZP with GPP as prenyl donor were very low in AnaPT reactions. Recently, a fungal prenyltransferase AtaPT was demonstrated to carry an unprecedented promiscuity toward diverse drug-like aromatic acceptors and prenyl donors including DMAPP, GPP, and FPP. On the availability of AtaPT, we investigated the behavior of AtaPT toward PIBP, PIVP, and PBZP. Twenty-one prenylated APs were isolated and their structures were elucidated by NMR and MS analyses. Total conversion yields were calculated for the three APs with AtaPT and DMAPP, which are significantly higher than those of AnaPT. C-prenylated products are in consistent with the AnaPT products. O-prenylated products were also obtained from the reaction mixtures of PIBP and PIVP. Also
Gem-diprenylated derivatives were identified in the reaction mixtures of these substrates
respectively. C-monoprenylated products were converted into gem-diprenylated derivatives
as predominant products in the presence of DMAPP. GPP and FPP also served as good
prenyl donors for the reaction of AtaPT. Only one C-prenylated derivative and one Oprenylated
derivative each were identified from these incubation mixtures.
Subsequently, prenylation of different flavonoids including flavanones and isoflavones by
AnaPT at C-6 of the A ring or C-3′ of the B ring was demonstrated. Twelve prenylated
flavonoids from incubation mixtures of flavonoids with AnaPT in the presence of DMAPP
were produced. Previous studies found that 7-DMATS accepted chalcones, isoflavonoids,
and flavanones much better than flavones and flavonols and mainly catalyzed prenylation at
C-6. AnaPT and 7-DMATS show different substrate preferences and prenylation positions.
In the third part of this thesis, we identified a key amino acid residue Tyr205 in FtmPT1 for
the interaction with its aromatic substrate brevianamide F. Saturation mutagenesis on this
position resulted in all nineteen possible mutants. FtmPT1_Y205N and FtmPT1_Y205L
differ from FtmPT1 in behaviors toward four cyclo-Trp-Pro isomers. Regularly C2-
prenylated derivatives were detected as main products of FtmPT1 reactions with all these
isomers. In contrast, the reversely C3-prenylated products were found to be the main products
in Y205N and Y205L reactions with cyclo-D-Trp-D-Pro, cyclo-D-Trp-L-Pro, and cyclo-L-Trp-
D-Pro, while regularly C2- and C3-prenylated derivatives were identified in their reaction
mixtures with cyclo-L-Trp-L-Pro. These results indicated that the isomers are in different
positions and orientations in the reaction chamber and Tyr205 is important for the prenyl
transfer reaction, but can be replaced by other amino acids.
The results obtained during this thesis demonstrate that AtaPT and AnaPT could be
promising candidates for production of prenylated APs like -bitter acids by synthetic
biology. AnaPT and 7-DMATS could be used complementarily for prenylation of flavonoids.
The mutants of FtmPT1 can be used for production of regularly C3-prenylated brevianamide
F in synthetic biology.
Zusammenfassung:
Pflanzen, Bakterien und Pilze produzieren vielseitige primäre und sekundäre Stoffwechselprodukte. Beispiele der Sekundärstoffe sind Flavonoide, Coumarine, Xanthone und Indolalkaloide. Das Anhängen von Isopreneinheiten (n x C5), wie Dimethylallyl (DMAPP), Geranyl (GPP) oder Farnesyl (FPP) an aromatischen Grundstrukturen des Sekundärmetabolismus ist ein weiterer Schritt in der Diversifizierung dieser Stoffe. Die prenylierten Naturstoffe zeigen häufig stärkere pharmakologische Aktivitäten als ihre nicht-prenylierten Vorgänger. In der Natur wird die Übertragung der Prenyleinheit von Prenyltransferasen realisiert. Aus diesem Grund können Prenyltransferasen genutzt werden, um aromatische Substanzen zu modifizieren und somit neue biologisch aktive Stoffe herzustellen. Prenylierte Acylphloroglucinole (APs), die sich durch bemerkenswerte chemische Strukturen und verblüffende biologische und pharmakologische Aktivitäten auszeichnen, sind charakteristische Sekundärstoffe verschiedener Pflanzenfamilien. Wichtige Strukturmerkmale von prenylierten APs sind hoch oxidiert und dicht verziert mit Prenylgruppen, wie Dimehylallyl- und Geranyleinheiten. Phlorisobutyrophenone (PIBP), Phlorisovaerophenone (PIVP) und Phlorbenzophenon (PBZP) sind die Vorstufen der meisten prenylierten APs. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Akzeptanz der APs durch dreizehn pilzliche Prenyltransferasen in der Gegenwart von DMAPP untersucht. Neun regulär prenylierte Produkte wurden durch Einsatz von AnaPT erhalten. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass AnaPT dieselben Prenylierungen von PIBP und PIVP wie die membrangebundenen Prenyltransferasen, wie z.B. HIPT-1, katalysiert, welche in die Biosynthese von prenylierten APs in Pflanzen involviert sind. Die Umsatzrate mit AnaPT sind jedoch deutlich höher als mit HIPT-1. Allerdings wurden nur monoprenylierte Derivate in Gegenwart von DMAPP erhalten und die Umsatzraten von PIBP, PIVP und PBZP mit GPP als Prenyldonor waren sehr gering. Vor Kurzem wurde mit der pilzlichen Prenyltransferase AtaPT eine außergewöhnliche Promiskuität gegenüber diversen Arzneimittel-relevanten aromatischen Akzeptoren und Prenyldonoren, darunter DMAPP, GPP, und FPP, nachgewiesen. Daraufhin untersuchten wir das Verhalten von AtaPT gegenüber PIBP, PIVP und PBZP. Einundzwanzig prenylierte APs wurden isoliert und ihre Strukturen mittels NMR und MS aufgeklärt. Die Umsetzungen der drei APs wurden mit AtaPT und DMAPP bestimmt und waren deutlich höher als die mit AnaPT. Gleiche C-prenylierte Produkte wie AnaP-Reaktionen wurden identifiziert. O-prenylierte Produkte wurden aus den Reaktionen mit
PIBP und PIVP erhalten. Auch Gem-diprenylierte Derivate konnten in den
Reaktionsgemischen identifiziert werden. C-monoprenylierte Produkte wurden in
Anwesenheit von DMAPP hauptsächlich zu gem-diprenylierte Derivate umgesetzt. GPP und
FPP waren auch gute Prenyldonoren der AtaPT-Reaktionen. Nur ein einziges C-prenyliertes
und ein O-prenyliertes Derivat konnten aus diesen Reaktionen identifiziert werden.
Anschließend wurden Prenylierungen verschiedener Flavonoide, darunter Flavanone und
Isoflavone durch AnaPT am C-6 des A-Rings und dem C-3´ des B-Rings untersucht. Zwölf
prenylierte Flavonoide wurden in den Reaktionsgemischen von Flavonoiden und AnaPT in
der Gegenwart von DMAPP produziert. Es ist bekannt, dass 7-DMATS Chalcone,
Isoflavonoide und Flavanone deutlich besser als Flavone oder Flavonole akzeptiert und
hauptsächlich die Prenylierung am C-6 katalysiert. AnaPT und 7-DMATS zeigen
unterschiedliche Substratpräferenzen und Prenylierungspositionen.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die für die Interaktion von FtmPT1 mit dem
aromatischen Substrat Brevianamide F Schlüssel-Aminosäure Tyr205 identifiziert. Mittels
Sättigungsmutagenese an dieser Position wurden Mutanten von allen übrigen 19
Aminosäuren hergestellt. FtmPT1_Y205N und FtmPT1_Y205L unterscheiden sich von
FtmPT1 in ihrem Verhalten gegenüber den vier cyclo-Trp-Pro Isomeren. Regulär C2-
prenylierte Derivate wurden als Hauptprodukte der FtmPT1 mit diesen Isomeren identifiziert.
Dagegen waren revers C3-prenylierte Produkte die Hauptprodukte von Y205N und Y205L
mit cyclo-D-Trp-D-Pro, cyclo-D-Trp-L-Pro und cyclo-L-Trp-D-Pro, während regulär C2- und
C3-prenylierte Derivate mit cyclo-L-Trp-L-Pro nachgewiesen wurden. Diese Ergebnisse
lassen darauf schließen, dass die Isomere in unterschiedlichen Positionen und Orientierungen
im aktiven Zentrum vorliegen und Tyr205 für die Reaktion zwar wichtig ist, jedoch durch
andere Aminosäuren ersetzt werden kann.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass AtaPT und AnaPT vielversprechend Kandidaten
für die Produktion von prenylierten APs, wie beispielweise -Bittersäuren im Rahmen der
synthetischen Biologie sein können. AnaPT und 7-DMATS könnten komplementär für die
Prenylierung der Flavonoide genutzt werden. Die Mutanten der FtmPT1 können für die
Produktion von regulär C3-prenyliertem Brevianamid F in der synthetischen Biologie genutzt
werden.
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