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Zusammenfassung:
Die Synthetische Biologie benötigt Strategien, die effizientes Genetic Engineering erlauben. Eine grundlegende Voraussetzung hierzu ist die Etablierung von Techniken zur spezifischen DNA-Modifikation im Umfang einzelner Nukleotide bis hin zu ganzen Chromosomen. Während für Modellorganismen der Synthetischen Mikrobiologie ein großes Repertoire leistungsfähiger Werkzeuge zur Verfügung steht, war das Methodenspektrum zur genetischen Veränderung von Rhizobien aus der Klasse der Alphaproteobakterien lange Zeit eingeschränkt. In symbiotischen Lebensgemeinschaften mit Leguminosen besitzt Sinorhizobium meliloti die Fähigkeit, atmosphärischen Stickstoff zu biogenen Stickstoffverbindungen zu assimilieren, wodurch dem α-Rhizobium insbesondere landwirtschaftliche Relevanz zukommt. Aufgrund seiner besonderen Genomarchitektur, die neben einem Chromosom ein weiteres Chromid (pSymB) und Megaplasmid (pSymA) aufweist, ist S. meliloti außerdem ein Modellorganismus zur Erforschung mehrteiliger Genome in Bakterien. pSymA und pSymB, die ~45% der genomischen DNA tragen, besitzen repABC-basierte Replikationsursprünge, welche die Integration dieser extra-chromosomalen Replikons in den Zellzyklus vermitteln. Die repABC-Region wurde in dieser Arbeit als funktionelle Einheit identifiziert, die Chromosomen-ähnliche Eigenschaften wie eine stabile Vererbung und einfache Kopienzahl vermittelt. Auf Basis heterologer repABC-Kassetten verschiedener α-Rhizobien konnte außerdem ein Shuttle-Vektorsystem etabliert werden. Ein modulares und standardisiertes Assemblierungssystem ermöglichte hierbei die in-vitro Herstellung artifizieller Mini-Replikons. Diese können sowohl als klassische Klonierungsvektoren in E. coli, aber auch zur Etablierung mehrteiliger Expressionssysteme in S. meliloti eingesetzt werden. Eine neue Genome Editing-Methode sowie verbesserte Cre/lox-basierte Rekombinationsstrategien wurden entwickelt und erweitern das Repertoire genetischer Werkzeuge für S. meliloti. Ihre Anwendung konnte mittels Deletion und Inversion umfangreicher Genomabschnitte, sowie substantieller Genom-Umstrukturierungen demonstriert werden. Cre/lox-Anwendungen und eine Methode zur in-vivo Klonierung großer DNA-Fragmente ermöglichen neue experimentelle Ansätze, die bei der mechanistischen Aufklärung des mehrteiligen Genoms sowie in synthetischen Anwendungen von großem Nutzen sind. Die robuste Funktion des Cre/lox-Systems und die weite Verbreitung repABC-basierter Replikons innerhalb der α-Rhizobien bergen zudem das Potential, die in dieser Arbeit etablierten Methoden auf weitere Vertreter dieser landwirschaftlich und biotechnologisch relevanten Organismen zu übertragen.

Bibliographie / References

1. 3.2.2 repABC-Engineering hat biologisches und synthetisches Anwendungspotential 4. Fazit
2. 2. Döhlemann, J; Brennecke, M; Becker; A (2016). Cloning-free genome engineering in 1. Zusammenfassung
3. 6.3 Cloning-free genome engineering in Sinorhizobium meliloti advances applications of Cre/loxP site-specific recombination
4. 3.1.1 Etablierung von Sinorhizobium meliloti Rm1021 als Engineering-Plattform 3.1.2 Cre/lox-Rekombinationssysteme ermöglichen substantielle Genom-Umstrukturierungen 3.2 Entwicklung neuer Genetic Engineering-Ansätze mit hohem Anwendungspotential in biotechnologischen und biologischen Fragestellungen
5. 2.1.1 Genetische Werkzeuge zur in-vivo Modifikation einzelner Gene und bakterieller Genome 2.1.1.1 Methoden des ortsspezifischen Genome Editings
6. 6.1 Konstruktion der S. meliloti Fusionsstämme SmAB und SmABC 6.2 Spatiotemporal choreography of chromosome and megaplasmids in the Sinorhizobium meliloti cell cycle
7. 3.2.1.3 Die Cre/lox-vermittelte Relokalisation eines DNA-Fragments ermöglicht die in-vivo Klonierung großer Gen-Cluster
8. 3.1 Optimierung und Entwicklung neuer Genome Editing- und Engineering-Verfahren für Sinorhizobium meliloti
9. 2.1.1.2 Rekombinasen ermöglichen umfangreiche in-vivo DNA-Modifikationen 2.1.2 Genome Engineering in der Synthetischen Mikrobiologie 2.2 Sinorhizobium meliloti ist ein Stickstoff-Fixierer mit landwirtschaftlicher Bedeutung 2.2.1 Alphaproteobakterien besitzen mehrteilige Genome mit repABC-basierten Replikationsursprüngen
10. 2.2.2 Sinorhizobium meliloti als Modellorganismus der Synthetischen Mikrobiologie 2.3 Ziele der Arbeit
11. 3.2.1.1 pABC Shuttle-Vektoren sind artifizielle Mini-Replikons mit modularem Aufbau 3.2.1.2 Ein konserviertes Motiv im repABC-Operon

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