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Titel: Konstruktion, Charakterisierung und Optimierung des synthetischen, sekundären Chromosoms synVicII in Escherichia coli
Autor: Messerschmidt, Sonja
Weitere Beteiligte: Waldminghaus, Torsten (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0944
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0944
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-09440
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Construction, characterization and optimization of the synthetic, secondary chromosome synVicII in Escherichia coli

Dokument

Schlagwörter:
Replikation, Synthetische Biologie, Escherichia coli, sekundäres Replikon, DNA replication, Synthetic Microbiology, secondary replicon

Zusammenfassung:
Synthetische, sekundäre Chromosomen sind ein wertvolles Werkzeug, um Chromosomenorganisationssysteme zu untersuchen. Anhand ihres Designs, ihrer Assemblierung und ihrer Charakterisierung können auch wichtige Konstruktionsregeln für synthetische Chromosomen abgeleitet werden. In der Biotechnologie könnten außerdem synthetische, sekundäre Chromosomen genutzt werden, um Mikroorganismen genetisch zu verändern. Für alle Anwendungen ist es wichtig, dass das verwendete synthetische, sekundäre Replikon gut charakterisiert und beschrieben worden ist. In dieser Arbeit wurde das synthetische, sekundäre Chromosom synVicII im monochromosomalen Bakterium Escherichia coli etabliert und charakterisiert. Als Vorbild für synVicII diente das natürlich vorkommende sekundäre Chromosom II von Vibrio cholerae, einem Bakterium, welches zwei unterschiedlich große Chromosomen besitzt. So wurden der Replikationsursprung des zweiten V. cholerae Chromosoms oriII, das Initiatorgen rctB und das eigene Chromosomen II Segregationssystem parABII in synVicII integriert. Transformation in E. coli bewies, dass synVicII erfolgreich in E. coli replizieren kann. Für die effiziente Assemblierung, Modifizierung und den Transfer von synVicII wurden verschiedene Elemente eingebaut: Beispielsweise macht ein integrierter oriT synVicII konjugierbar, ein Hefereplikationsursprung und ein Selektionsmarker erlauben die Assemblierung in S. cerevisiae und eine Flp-FRT-Kassette erlaubt die Entfernung von nur für die Konstruktion wichtigen Elementen. SynVicII wurde ModularCloning kompatibel entwickelt, sodass schnell und effizient neue DNA-Sequenzen eingebaut werden können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde synVicII auf wesentliche Charakteristika bakterieller Chromosomen wie die Stabilität, die Kopienzahl und die genetische Integrität untersucht. Mit einem neu entwickelten Durchflusszytometrie-basierten Stabilitätstest konnte gezeigt werden, dass synVicII deutlich stabiler als ein oriC-basiertes Replikon, synEsc, ist. Ein Plattentest bestätigte die mit dem neu entwickelten Durchflusszytometrie-basierten Stabilitätstest bestimmte Replikonverlustrate von synVicII. Der Plattentest demonstrierte auch, dass synVicII instabiler als ein 100 % stabiles synF-Plasmid ist. Mit einem neu entwickelten Evolutionsexperiment konnten neue stabilere synVicII-Varianten entwickelt und identifiziert werden. synVicII besitzt in E. coli eine vergleichbar niedrige Kopienzahl relativ zu oriC, was anhand von qPCR und Microarray-Analysen geklärt werden konnte. Die Kopienzahl-Analyse deutete sogar darauf hin, dass synVicII in E. coli ähnlich wie das zweite Chromosom in V. cholerae repliziert. Demnach startet synVicII vermutlich später die DNA-Replikation als das E. coli Chromosom. Southern Blot Analysen demonstrierten, dass synVicII im Gegensatz zu synEsc nicht in das E. coli Chromosom integriert. Neben sekundären Chromosomen könnten auch noch zusätzlich tertiäre Chromosomen in der Biotechnologie zum Einsatz kommen. Deswegen wurde die Diversität der sekundären Chromosomen von Vibrionaceae untersucht. Marker-Frequency-Analysen deuten darauf hin, dass alle sekundären Chromosomen in den 11 untersuchten Vertretern der Vibrionaceae die DNA-Replikation später initiieren als das erste Chromosom und beide Chromosomen zusammen terminieren. Neun neue synthetische Chromosomen mit verschiedenen Vibrionaceae Replikationsursprüngen wurden assembliert und ihre Eignung als tertiäres Chromosom initial getestet. Mit Konjugationstests wurde demonstriert, dass alle verwendeten Vibrionaceae Replikationsursprünge untereinander nicht kompatibel sind. Zusammengefasst besitzt synVicII mit seinen bisherigen charakterisierten Chromosomeneigenschaften schon großes Potenzial, um in der Grundlagenforschung und Biotechnologie eingesetzt werden zu können.

Summary:
Synthetic secondary chromosomes are valuable tools to study chromosome maintenance systems. Important construction rules for synthetic chromosomes can be derived from their design, assembly and characterization. Furthermore, synthetic secondary chromosomes can be used to genetically modify microorganisms for biotechnology. For all applications, it is important that the synthetic secondary replicon employed is well described and characterized. In this work the synthetic secondary chromosome synVicII was established and characterized in the monochromosomal bacterium E. coli. The natural occurring secondary chromosome II of Vibrio cholerae, a bacterium which possesses two different sized chromosomes, was used as template for synVicII. The replication origin of V. cholerae chromosome II oriII, the initiator gene rctB and the specific chromosome II segregation system parABII were successfully integrated into synVicII. Transformation of synVicII proved that the synthetic secondary chromosome is able to replicate in E. coli. For the efficient assembly, modification and transfer of synVicII, different elements were inserted in synVicII: For example, an integrated oriT allows the conjugal transfer of synVicII, a yeast replication origin and a selection marker allows the assembly in yeast and a Flp-FRT-cassette allows the removal of elements only needed for construction after transfer to final strain. SynVicII was developed to be compatible with ModularCloning, which allows the fast and efficient integration of new DNA sequences. In the second part of this work synVicII was investigated regarding typical chromosome characteristics such as stability, copy number and genetic integrity. With a newly developed flow-cytometry based stability assay it was shown that synVicII is more stable than an oriC-based replicon, synEsc. A plate counting test confirmed these results and further demonstrated that synVicII is more unstable than a 100 % stable synF-plasmid. With a developed directed evolution experiments, new stable synVicII variants were identified. synVicII revealed in E. coli a comparable low copy number relative to oriC, the replication origin of the E. coli chromosome, which was shown by qPCR and microarray analysis. Copy number analysis also indicated that synVicII replicates in E. coli similarly to chromosome II in V. cholerae. Thus, synVicII probably starts DNA replication later than the E. coli chromosome. Southern Blot experiments demonstrated that synVicII in comparison to synEsc does not integrate into the E. coli chromosome. Besides secondary chromosomes, tertiary chromosomes could also be applied in biotechnology. Therefore, the diversity of secondary chromosomes of Vibrionaceae was investigated. Marker frequency analysis indicated that the eleven analyzed members of Vibrionaceae initiate DNA replication of the secondary chromosomes later than that of the primary chromosome; replication of both chromosomes is terminated simultaniously. Nine new synthetic secondary chromosomes with different Vibrionaceae replication origins were assembled and their potential as tertiary chromosome was initially tested. Conjugation experiments showed that all used Vibrionaceae replication origins are not compatible with each other. Taken together and based on the characteristics so far, synVicII revealed great potential to be applied in basic research and biotechnology.


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