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Titel: Charakterisierung der DNA-Replikation in genetisch modifizierten Escherichia coli Stämmen durch neue Methoden der Synthetischen Biologie
Autor: Milbredt, Sarah
Weitere Beteiligte: Waldminghaus, T. (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0943
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0943
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-09430
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Characterization of DNA replication in genetically modified Escherichia coli strains by new methods of synthetic biology

Dokument

Schlagwörter:
Escherichia coli, Replikation, Synthetische Biologie, Escherichia coli, DNA replication, synthetic microbiology,

Zusammenfassung:
Eukaryoten und Prokaryoten unterscheiden sich in der Organisation ihrer Genome. Prokaryoten tragen mehrheitlich ein zirkuläres Chromosom, welches von einem Replikationsursprung repliziert wird. Das eukaryotische Genom hingegen umfasst mehrere lineare Chromosomen, die mehr als einen Replikationsursprung enthalten. In wie weit die prokaryotische Genomorganisation der eukaryotischen angepasst werden kann, ist eine spannende Frage, von deren Antwort grundlegende Konstruktionsregeln für die Entwicklung von synthetischen Chromosomen abgeleitet werden könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden Escherichia coli Stämme mit multiplen Replikationsursprüngen und Chromosomen bezüglich ihrer DNA-Replikation untersucht und es wurde eine fluoreszenzbasierte Einzelzell-Methode designt und etabliert, die eine verbesserte „signal to background ratio“ aufweist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können wie folgt zusammengefasst werden: I. E. coli toleriert einen zusätzlichen Replikationsursprung auf dem Chromosom, der aktiv repliziert. Dieser Ansatz funktioniert sowohl mit einer zusätzlichen Kopie von oriC, als auch mit oriII, dem Replikationsursprung des zweiten Chromosoms von V. cholerae. Es konnte gezeigt werden, dass eine verkürzte oriC-Sequenz, die keine DnaA-Box R4 enthält, nicht ausreichend für die DNA-Replikation auf dem nativen Chromosom ist. Wird oriII als extra Replikationsursprung eingesetzt, verläuft die DNA-Replikation dysreguliert. Diese Dysregulation wird aufgehoben, sobald sich oriC und oriII nicht mehr auf dem gleichen Chromosom, sondern auf zwei unterschiedlichen Replikons befinden. II. Für das Design und die Assemblierung von DNA-Sequenzbibliotheken zur chromosomalen Integration in Bakterien wurde das Programm MARSeG (Motif Avoiding Randomized Sequence Generator) geschrieben und das MoClo-System optimiert. Mit dem Sequenzgenerator MARSeG, ist es möglich Sequenzen zu designen, die eine hohe Variabilität aufweisen und gleichzeitig bestimmte DNA-Motive ausschließen. Das MoClo-System wurde optimiert um die Klonierungseffizienz zu erhöhen, Assemblierungen im Bibliotheken-Maßstab zu vereinfachen und eine Genomintegration assemblierter DNA-Fragmente einfacher zu gestalten. Mit Hilfe von MARSeG und den modifizierten MoClo-Vektoren konnte das Design und der Aufbau eines LacO/TetO hybrid FROS-Arrays effizient und schnell vollzogen werden. III. Es wurde eine neue Einzelzell-Methode etabliert mit der das Hintergrundsignal konventioneller FROS (Fluorescence Repressor Operator System) stark reduziert wird. Die neue Methode BiFCROS (Bimolecular Fluorescence complementation and Repressor Operator System) basiert auf Fusionen aus Repressoren und fragmentierten Fluoreszenzproteinen, die an ein hybrid FROS-Array binden, wodurch es durch Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation zu einem Fluoreszenzsignal kommt. BiFCROS enthält im Vergleich zum konventionellen FROS eine deutlich verminderte Hintergrundfluoreszenz, weil nur Proteine fluoreszieren, die an das Operator-Array gebunden sind. Um zu analysieren, ob BiFCROS für die Kopienzahlbestimmung von Genloki eingesetzt werden könnte, wurde es in diese Richtung weiterentwickelt. Anhand der Fluoreszenzintensität der gesamten Zelle könnte Rückschluss auf die Kopienzahl des hybrid FROS-Arrays gezogen werden, weil diese mit Anstieg der Kopienzahl proportional zunehmen sollte.

Summary:
Eukaryotes and prokaryotes differ in the organization of their genomes. Most prokaryotes contain a single, circular chromosome that is replicated by one single replication origin. Contrary, eukaryotes possess multiple, linear chromosomes, which are replicated by more than one replication origin. Whether, and to what extent, Escherichia coli tolerates an eukaryotic genome organization is an exciting question whose answer could help to develope construction rules for synthetic chromosomes. This thesis presents DNA replication studies of E. coli strains with multiple-origins on the chromosome and an E. coli strain with two linear chromosomes. Additionally, a fluorescence-based single-cell method has been designed and established, which has an improved "signal to background ratio". The main results can be summarized as follows: I. E. coli tolerates additional replication origins on the native chromosome, which are able to initiate DNA replication. DNA replication activity of extra copies of oriC or oriII, the replication origin of the second chromosome of V. cholerae, could be verified. A shortened sequence of oriC, which does not contain DnaA box R4, is not sufficient to initiate DNA replication on the native chromosome. If oriII is used as additional replication origin, DNA replication shows dysregulated patterns, which are abolished if oriC and oriII locate on two different replicons within the cell. II. For design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal integration into bacteria the program MARSeG (Motif Avoiding Randomized Sequence Generator) was written and the modular cloning system MoClo was modified. MARSeG allows the design of sequences with a high variability and the simultaneous exclusion of certain motifs. MoClo has been optimized to increase cloning efficiency, to simplify assembly operations in library scale and to facilitate genomic integration of assembled DNA fragments. MARSeG and the modified MoClo vector were used to design and construct a LacO/TetO hybrid FROS array. III. A low background FROS (Fluorescence Repressor Operator System) was designed and established. The new method BiFCROS (Bimolecular Fluorescence complementation and Repressor Operator System) is based on fusions of repressor proteins with a split fluorescent protein, which bind to a hybrid FROS array resulting in fluorescence signals due to bimolecular fluorescence complementation. Background fluorescence is reduced, because only proteins that are bound to the hybrid FROS array fluoresce. In order to analyze whether BiFCROS could be used for copy number determination of gene loci, it was further developed in this direction. Thus, total cell fluorescence intensity should reveal the copy number of the hybrid FROS array, because it should increase proportionally with increasing copy number.


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