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Titel: Charakterisierung immuninhibitorischer Eigenschaften von SIGIRR und die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humanes SIGIRR
Autor: Kumler, Jasmin Ute
Weitere Beteiligte: Bauer, Stefan (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0883
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0883
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-08834
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Characterization immuninhibitory properties of SIGIRR and the production of monoclonal antibodies against human SIGIRR

Dokument

Schlagwörter:
Immunologie, Toll-like-Rezeptoren, Monoklonaler Antikörper, SIGIRR, IL-1R8, TIR8, SIGIRR, IL-1R8, TIR8

Zusammenfassung:
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden immuninhibitorische Eigenschaften SIGIRRs in der Stimulation primärer muriner Zellen untersucht. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humanes SIGIRR. Fragestellung der Arbeit war es, eine Beteiligung SIGIRRs an der Immunregulation muriner Milzzellen, B-Zellen und myeloiden dendritischen Zellen in Bezug auf unterschiedliche Tolllike Rezeptoren aufzuzeigen und zu charakterisieren, wann und ggf. durch welche Mechanismen eine solche zustande kommt. Hergestellte und auf ihre Eigenschaften hin untersuchte monoklonale Antikörper gegen humanes SIGIRR sollten genutzt werden um die Expression SIGIRRs mithilfe Immunfluoreszenz zu untersuchen. Dazu wurden zum Einen aus der Maus isolierte Zellen von Wildtypmäusen im Vergleich zu SIGIRR-Knockoutmäusen stimuliert und in ihrem Reaktionsmuster verglichen. Zum Anderen wurden, nach Immunisierung von SIGIRR-Knockoutmäusen mit SIGIRR, Hybridoma-Zellen generiert. Diese wurden auf die Produktion brauchbarer Antikörper getestet und die resultierenden Antikörper auf ihre Anwendbarkeit in ELISA, Westernblot und FACS untersucht. In den Stimulationsexperimenten zeigt sich entgegen der Hypothese keine Unterschiede zwischen WT-Mäusen und SIGIRRKnockoutmäusen bei der Stimulation mit unterschiedlichen LPS Liganden für Milzzellen, B-Zellen und myeloide dendritische Zellen. Eine Einfluss SIGIRRs auf die Immunregulation dieser Zellen konnte damit, entgegen der Aussage einschlägiger Literatur, unter den hier angewandten Bedingungen nicht nachgewiesen werden. Lediglich Vorexperimente mit MACS separierten CD11c+ konnten Hinweise auf einen solchen Sachverhalt liefern. Die Antikörperherstellung lieferte spezifische Antikörper gegen humanes SIGIRR mit guten Bindungseigenschaften in ELISA und Westernblot. Im FACS konnte in der Oberflächenfärbung SIGIRR an der Oberfläche von mit SIGIRR und Signalpeptid transfizierten HEK-Zellen nachgewiesen werden. Damit ist in den Stimulationsexperimenten insbesondere die Abweichung von der gestellten Hypothese und den meisten bisherigen Publikationen bemerkenswert, wodurch die Diskussion möglicher Ursachen, wie sie in der vorliegenden Arbeit unternommen wird, entscheidend für mögliche zukünftige Ansätze ist. Problematisch in der Antikörperherstellung zeigte sich die in fortlaufender Kultur beständig nachlassende Antikörperproduktion, bzw. eine verminderte Spezifität der produzierten Antikörper. Es konnten mit den bereits gewonnenen Antikörpern jedoch einige Aufschlüsse zu SIGIRR erzielt werden. In zukünftigen Experimenten bietet sich die Verwendung von MACS separierten CD11c positiver dendritischer Zellen in Stimulationsexperimenten mit SIGIRR-Knockoutmäusen an. Die laborinterne Herstellung SIGIRR-spezifischer Antikörper ist eine zeitintensive aber erfolgversprechende Methode, wenn ausreichend früh Subklonierungen durchgeführt werden, muss aber gegen die Möglichkeit eines käuflichen Erwerbs abgewogen werden. Mit SIGIRR-spezifischen Antikörpern könnte insbesondere, z.B. mit fluroeszenzmarkierten Antikörpern, das Expressionsmuster von SIGIRR in Zellen untersucht werden.

Summary:
The first part of this thesis focuses on the immuninhitory properties of SIGIRR in the stimulation of primary murine cells. The second part describes the production of monoclonal antibodies against human SIGIRR. The central question of this theses was to distinguish the role of SIGIRR regarding the immunregulation of murine spleen cells, B-cells and myeloid Dendritic Cells via toll-like receptors and the circumstances under which those would come to pass. Monoclonal antibodies against human SIGIRR were to be raised, characterised and used in immunfluorescence-aided expression studies on SIGIRR. For this purpose, for one, different stimuli were used on wildtype versus SIGIRR-knockout mouce cells comparing the resulting IL-6 reaction. Secondly, SIGIRR-knockout mice were inoculated with SIGIRR and hybridoma cells producing SIGIRR-specific antibodies were generated. Antibodies were then tested for usage in ELISA, Western Blot and FACS. In violation of the original hypotheses, the stimulation experiments with different TLG-ligands showed not differences in the IL-6 production between wildtype or SIGIRR-knockout in spleen cells, B-cells or myeloid Dendritic Cells. Hence no immunregulative influence of SIGIRR on TLRsignaling was evident in this experimental environment, though most current studies would suggest otherwise. Solely preliminary tests with MACS-separated CD11c+ mDCs were in favour of the stated theses. The raising of antibodies resulted in SIGIRR-specific antibodies with good binding-properties in ELISA and Western blot. FACS results showed SIGIRR on the surface of HEK cells transfected with SIGIRR and signalpeptide. The results obtained in the stimulation experiments deviated remarkably from the stated thesis and current publications. Therefore the reflection of probable causes as discussed here might be essential for future endeavour. Though some results could be achieved from SIGIRR-specific antibodies, raising SIGIRR-specific antibodies was limited by the ability of hybridoma cells to produce antibodies in continous culture and stable hybridoma cell clones could not be obtained. In future stimulation experiments with SIGIRR-knockout mice the use of MACS-separated CD11c positive myeloid Dendritic Cells seems to be most promising. The raising of SIGIRRspecific antibodies in the laboratory is a time-consuming but promising method, if early subcloning is respected, but purchasing antibodies on the market should also be taken in consideration. SIGIRR-specific antibodies could be used e.g. via fluorescence-marking in studies on the expressionpattern of SIGIRR in different cell lines.


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