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Titel: Identification of Nova1 as a novel modulator of microRNA function in neurons
Autor: Thümmler, Juliane
Weitere Beteiligte: Schratt, G. (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0662
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0662
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-06624
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Identifikation von Nova1 als neuer Modulator der mikroRNA-Funktion in Neuronen

Dokument

Schlagwörter:
MikroRNA, Neuronen, MicroRNA, Neurons

Summary:
The proper development, differentiation and plasticity of the nervous system require an accurate regulation at multiple levels of gene expression. One important class of post-transcriptional regulators are microRNAs (miRNAs), tiny RNA molecules that inhibit protein synthesis of target mRNAs at the level of mRNA translation and stability. MiRNAs have well documented roles in the control of neuronal development and function. Specific miRNAs, such as miR-134, regulate the local dynamic translation of mRNAs at the synapse thereby controlling activity-dependent changes in synaptic strength. MiRNAs regulate mRNA translation within a large RNA-protein complex, the microRNA-induced silencing complex (miRISC). Whereas the core components of miRISC, e.g. Argonaute (Ago) and GW182 proteins, are highly conserved, cell-type specific auxiliary proteins play important roles in the modulation of miRISC activity. The molecular mechanisms by which miRISC activity is specifically regulated in the neuronal system by such auxiliary proteins however are poorly described. This project presents the validation and evaluation of the first large scale screening study that was performed in order to find novel RNA-binding proteins (RBPs) that regulate miRISC activity in primary neurons. The RNAi-based screen identified the RBPs Nova1, Ncoa3 and Ewsr1 as new modulators of miRISC in neurons and further confirmed the function of two previously reported miRISC interacting proteins (Ddx6, Tnrc6c). Subsequently, Nova1 was chosen for follow-up experiments directed at the elucidation of the underlying molecular mechanisms. Using luciferase reporter assays for targets of multiple neuronal miRNAs in addition to miR-134, I obtained evidence that Nova1 regulates miRNA activity in neurons in a general manner. In addition, I found that Nova1 can act as a regulator of miRNA activity irrespective of the 3‘UTR context. Further data demonstrated that Nova1 interacts with Ago and the miR-134 target mRNA Limk1. Investigations on the functional relevance of this mechanism revealed that Nova1 is required for miR-134 mediated spine size reduction. Furthermore, I could show that Nova1 is necessary for the upregulation of Limk1 translation upon treatment with brain-derived neurotrophic factor (BDNF), suggesting that Nova1 could be involved in the stimulus-dependent control of neuronal mRNAs. In summary, Nova1 was identified as a new modulator of miRISC activity in neurons and the underlying mechanism was characterized in detail. The data obtained during the thesis project suggests that Nova1 is involved in the dynamic activity-dependent regulation of miRNA function in neurons.

Zusammenfassung:
Die korrekte Entwicklung, Differenzierung und Plastizität des Nervensystems erfordern eine genaue Regulation auf multiplen Ebenen der Genexpression. Eine wichtige Klasse post-transkriptioneller Regulatoren sind mikroRNAs (miRNAs), winzige RNA-Mole-küle, welche die Proteinsynthese von Ziel-mRNAs auf der Ebene der mRNA-Translation und -Stabilität inhibieren. MiRNAs haben wichtige Aufgaben in der Kontrolle der neuronalen Entwicklung und Funktion. Spezifische miRNAs, wie z. Bsp. miR-134, regulieren die lokale dynamische Translation von mRNAs an der Synapse, wodurch sie aktivitätsabhängige Veränderungen der Synapsenstärke kontrollieren. MiRNAs regulieren die mRNA Translation innerhalb eines großen RNA-Protein-Komplexes, des mikroRNA-induzierten Silencing Komplexes (miRISC). Während die Kernkomponenten des miRISC, wie z Bsp. Argonaute (Ago) und GW182 Proteine, hoch konserviert sind, kommen Zelltyp-spezifischen Proteinen wichtige Aufgaben in der Modulation der miRISC-Aktivität zu. Die molekularen Mechanismen, durch welche die miRISC-Aktivität speziell im neuronalen System durch solche zusätzlichen Proteine reguliert wird, sind nur unzulänglich beschrieben. Dieses Projekt stellt die Validierung und Evaluierung der ersten umfangreichen Screening-Studie dar, die durchgeführt wurde, um neue RNA-bindende Proteine (RBP) zu identifizieren, welche die miRISC-Aktivität in primären Neuronen regulieren. Der RNAi-basierte Screen identifizierte die RBPs Nova1, Ncoa3 und Ewsr1 als neue Modulatoren von miRISC in Neuronen und bestätigte außerdem zwei zuvor beschriebene miRISC-interagierende Proteine (Ddx6, Tnrc6c). Anschließend wurde Nova1 für nachfolgende Experimente ausgewählt, welche zur Aufklärung der zugrundeliegenden Mechanismen beitrugen. Durch die Anwendung von Luciferase-Reporter Assays für Ziel-mRNAs von multiplen neuronalen miRNAs neben miR-134 erbrachte ich Nachweise, dass Nova1 die miRNA-Aktivität in Neuronen auf generelle Weise reguliert. Zusätzlich fand ich heraus, dass Nova1 als Regulator der miRNA-Aktivität in Unabhängigkeit des 3’UTR Kontextes agieren kann. Weitere Daten zeigen eine direkte Interaktion von Nova1 mit der RISC Kernkomponente Ago und eine Assoziation mit der miR-134 Ziel-mRNA Limk1. Untersuchungen über die funktionale Bedeutung dieses Mechanismus zeigten, dass Nova1 für die miR-134-vermittelte Reduzierung der Größe von dendritischen Dornfortsätzen notwendig ist. Außerdem wurde gezeigt, dass Nova1 für die hochregulierte Translation der Limk1 mRNA nach BDNF-Behandlung notwendig ist. Dies lässt auf eine Mitwirkung von Nova1 in der Stimulus-abhängigen Kontrolle von neuronalen mRNAs schließen. Zusammenfassend wurde Nova1 als neuer Modulator der miRISC-Aktivität in Neuronen beschrieben und die zugrundeliegenden Mechanismen genauer charakterisiert. Die während dieser Doktorarbeit erhaltenen Daten deuten zusammengenommen auf eine Beteiligung von Nova1 in der dynamischen aktivitätsabhängigen Regulation der miRNA-Funktion in Neuronen hin.


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