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Titel: Überprüfung des Drug Delivery Konzepts von „Lipid-Nucleosid- und Polysaccharid-Konjugaten von 5-Fluorouracil“
Autor: Farhat, Anisa
Weitere Beteiligte: Kinscherf, Ralf (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0544
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0544
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-05447
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Verification of drug delivery concept of "lipid - nucleoside and polysaccharide conjugates of 5-fluorouracil"

Dokument

Schlagwörter:
5-Fluorouracil, 5-fluorouracil

Zusammenfassung:
2012 standen maligne Erkrankungen an zweiter Stelle der Todesursachenstatistik in Deutschland (Becker & Holzmeier 2012). Einen wichtigen Baustein in der Therapie der malignen Erkrankungen stellt die Chemotherapie dar. Trotz großer Fortschritte in den vergangenen Jahren konnte nur eine geringe Verbesserung des Überlebens der Patienten erzielt werden (Bourret et al. 1979, Krook et al. 1991). Das Uracil-Analogon 5-Fluorouracil (5-FU) ist ein Antimetabolit, der weit verbreitet in der Chemotherapie maligner Tumoren Anwendung findet (Bodner-Adler et al. 2007, Carrato 2008, Khosravi Shahi et al. 2007, Kish et al. 1994, Zhao et al. 2013). Eines der größten Handicaps von Chemotherapeutika, wie 5-FU, ist die insuffiziente Penetration der Zellmembran, die durch eine hohe Hydrophilie bedingt ist (Malecki et al. 2013a). Daher haben Prof. Dr. Rosemeyer und Frau Dr. Malecki im Rahmen eines Kooperationsprojekts (Prof. Rosemeyer, Osnabrück/Prof. Kinscherf, Marburg) verschiedene Derivate von 5-Fluorouridine (5-FUrd, 2a) entwickelt, welche lipophile Reste in N(3)- und/oder in 2‘3‘-O-Position tragen (3a-7a, 3c, 2c, 3b-7b), mit dem Ziel durch erhöhte Lipophilie der Derivate eine verbesserte Penetration und eine geringere Rate an Nebenwirkungen zu erreichen (Köstler et al 2013, Malecki et al. 2013a, Malecki et al. 2013b, Malecki et al. 2014, Malecki & Rosemeyer 2010, Rosemeyer et al. 2012, Rosemeyer & Malecki 2012, Werz et al. 2013). Zusätzlich wurde zum Vergleich das 2‘3‘-O-Nonadecylidene Derivat von Uridin, 3c, hergestellt (Köstler et al. 2013). In dieser Dissertation erfolgte die in vitro-Testung des Drug Delivery Konzeptes der „Lipid-Nucleosid- und Polysaccharid-Konjugate von 5-FU (2a, 3a-7a, 3c, 2c, 3b-7b)“ an den Krebszelllinien HT-29 (humanes Kolonkarzinom), HepG2 (humanes hepatozelluläres Karzinom), sowie RENCA (murine Nierenzellkarzinom) und an Zellen des Immunsystems, d.h. differenzierten, humanen Makrophagen (THP-1). Um die Frage zu klären, ob die Substanzen die Zellmembran passieren können, und in welchem Zellkompartiment sie danach lokalisiert sind, wurden HT-29-Zellen mit ATTO 245®-konjugierten Test-Substanzen (2c, 3b-7b) für 24 h inkubiert. Alle Derivate passierten die Zellmembran und akkumulierten im Zytoplasma, unter Aussparung des Zellkerns. Nur das Derivat 2c zeigte eine granulierte Verteilung im Zytoplasma. Ein Schwerpunkt dieser Dissertation war es, den Einfluss der Aufnahme der Testsubstanzen (3a-7a, 3c) auf die Proliferation und Apoptose der Zellen und die zytostatische/zytotoxische Aktivität der Derivate im Vergleich zu 5-FU (1) und 5-FUrd (2a) zu untersuchen. Nach 24 h, 48 h bzw. 72 h Inkubation der humanen Kolonkarzinomzellinie HT-29 mit den Derivaten 1 (5-FU) (14-23%, 35-46%, bzw. 30-58%) und 2a (5-FUrd) (33-45%, 60-67%, bzw. 58-67%) konnte im Vergleich zur Negativkontrolle eine signifikante Reduktion der Viabilität der Zellen beobachtet werden. Nach 24 h Inkubation der HT-29-Zellen zeigten in den Konzentrationen 40 µM und 80 µM die Derivate 3a (77% und 95%), 5a (30% und 86%) und 3c (89% und 96%) eine signifikante Abnahme der Viabilität im Vergleich zur Negativkontrolle. Diese drei Derivate zeigten nach 24 h Inkubation in den Konzentrationen 40 µM und 80 µM ebenfalls im Vergleich zur Positivkontrolle (1) eine signifikante Abnahme der Viabilität der HT-29-Zellen (61-81%, 73% bzw. 80-82%). Nach 48 h Inkubation der HT-29-Zellen mit den Derivaten konnte bei vier Derivaten in den Konzentrationen 40 µM und 80 µM eine signifikante Abnahme der Viabilität im Vergleich zu 5-FU (~Positivkontrolle) beobachtet werden: 3a (9-54%), 5a (5-48%), 7a (2-30%) und 3c (53-63%). Die Derivate 4a und 6a zeigten keinen Effekt auf die Viabilität der HT-29-Zellen. Die Derivate 3a, 5a, 7a und 3c zeigten auch bei anderen Krebszelllinien (RENCA und HepG2) eine signifikante Abnahme der Viabilität: Nach 48 h Inkubation der RENCA-Zelllinie mit den Derivaten, zeigten die Derivate 3a (51-57%) und 5a (56%) eine signifikante Abnahme der Viabilität im Vergleich zu 5-FU. Die Derivate 3c (38-49%) und 7a (25-44%) wiesen bei RENCA-Zellen ähnliche zytostatische Effekte auf, wie die Substanzen 1 (29-48%) und 2a (41-46%). Nach 48 h Inkubation der HepG2-Zelllinie mit den Derivaten konnte bei den Derivaten 3a (72-75%),5a (53%), 7a (43%) und 3c (22-74%) eine signifikante Abnahme der Viabilität im Vergleich zu 5-FU beobachtet werden. Von besonderem Interesse war das Ergebnis der Testung der Derivate an differenzierten THP-1-Makrophagen, um zwischen zytotoxischen Effekten und Nebenwirkungen unterscheiden zu können. Das Derivat 5a zeigte nach 48 h Inkubation eine signifikant um 6-27% erhöhte Zunahme der Viabilität im Vergleich zu 5-FU (~Positivkontrolle). Die mit ATTO 425®-konjugierten 5-Fluorouridinderivate 3b, 4b, 5b, 6b und 7b wurden bzgl. ihrer Effekte auf die Viabilität der HT-29-Kolonkarzinomzellen getestet, nach 24 h und nach 48 h Inkubationszeit. Die mit ATTO 425®-konjugierten 5-FUrd Derivate zeigten in allen getesteten Konzentrationen (10-80 µM) im Vergleich zur Kontrolle keine Unterschiede bzgl. Viabilität der Zellen. Nur das mit ATTO 425®-konjugierte 5-FUrd (2c) zeigte in den Konzentrationen 10-80 µM im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Abnahme der Viabilität der HT-29-Zellen um 31-52% bzw. 41-57%. Zusätzlich testeten wir den Einfluss der Derivate auf die Induktion der Apoptose und Proliferation im Vergleich zu 5-FU (1) und 5-FUrd (2a) bei HT-29-Zellen nach 1 h, 2 h, 4 h und 6 h Inkubationszeit. Das Derivat 5a zeigte signifikante Zunahmen der Apoptose bei 80 µM nach 2 h Inkubationszeit (um das 3,1-Fache), nach 4 h (um das 3-Fache) bzw. 6 h (um das 4-Fache). Nach 6 h Inkubation konnte bei 5a auch bei 40 µM eine signifikante Zunahme der Apoptose um das 3,3-Fache beobachtet werden. Des Weiteren wurde die Gensignatur (zur Testung der Signaltransduktion) der HT-29-Zellen nach Behandlung mit diesen Substanzen untersucht. In der Real-time PCR (qRT-PCR) zeigte das Derivat 5a bei 40 µM eine signifikante Zunahme der Expression des Tumorsuppressorgens p53 um das 2-Fache im Vergleich zur Negativ- und Positivkontrolle (5-FU), sowie eine 1,8-fache Zunahme der Expression des proapoptotischen Caspase 3 Gens. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei mehreren Krebszelllinien einige Derivate von 5-FUrd (2a) effektiver in ihrer Zytotoxizität sind, als 5-FU (1) oder 5-FUrd (2a). Besonders das Derivat 5a ist von großem Interesse, da es trotz der hohen zytotoxischen Aktivität bei Krebszelllinien, keine zytotoxischen Effekte bei differenzierten Makrophagen (~Immunzellen) zeigt. Das Derivat 5a könnte somit ein neuartiges, zytotoxisches, multipotentes Chemotherapeutikum darstellen. Zur abschließenden Beurteilung des pharmakologischen/therapeutischen Potentials sind allerdings weitere Untersuchungen, z. B. an Mikrotumoren/-sphären, sowie tierexperimentelle und prospektive klinische Studien notwendig.

Summary:
In 2012 malignant diseases were ranked at second position in German mortality statistics (Becker & Holzmeier 2012). Chemotherapy is one of the most important components in the therapy of malignant tumors. However, despite great advances in recent years only a marginal improvement of the survival of the patients could be achieved (Bourret et al. 1979, Krook et al. 1991). 5-Fluorouracil (5-FU) - an uracil analogue - is an antimetabilte, which is widely used in the therapy of malignant illnesses (Bodner-Adler et al. 2007, Carrato 2008, Khosravi Shahi et al. 2007, Kish et al. 1994, Zhao et al. 2013). One of the major handicaps of many chemotherapeutics- like 5-FU- is the insufficient penetration through cell membranes due to high hydrophobicity (Malecki et al. 2013a). Therefore, Prof. Dr. Rosemeyer und Dr. Malecki developed in a cooperation project (Prof. Rosemeyer, Osnabrück/Prof. Kinscherf, Marburg) several derivatives of 5-FUrd (2a) carrying lipophilic moieties at the N(3)- and/or in the 2‘3‘-O-position (3a-7a, 3c, 2c, 3b-7b) with the aim to improve the penetration and to achieve less side-effects due to higher lipophilicity (Malecki 2013, Köstler et al. 2013, Malecki et al. 2013b, Malecki et al. 2014, Malecki & Rosemeyer 2010, Rosemeyer, H., Malecki, E., Rosemeyer, H., Malecki, E., Werz, E., Korneev, S., Gall, K., Werz et al. 2013). Additionally, the 2‘3‘-O-Nonadecylidene derivative of uridine, 3c, was compounded for comparative reasons (Köstler et al. 2013). This dissertation describes the in vitro testing of the drug delivery concept of the „lipid-nucleoside- and polysaccharide-conjugate of 5-FU (2a, 3a-7a, 3c, 2c, 3b-7b) towards three carcinoma cell lines HT-29 (human colon carcinoma), HepG2 (human hepatoblastoma), RENCA (murine renal adenocarcinoma) and on differentiated human THP-1 macrophages. We incubated HT-29 cells for 24 h with ATTO 245®-conjugated substances (2c, 3b-7b) in order to find out, if the substances are able to pass the cell membrane and if so, in which cell compartment they were located after penetration. All derivatives passed the cell membrane and accumulated in the cytoplasm, all avoiding the nuclei, except derivative 5-FUrd (2c), which showed a granulated distribution in the cytoplasm (Malecki et al. 2013a). The impact of the absorption of the derivatives (3a-7a, 3c) on proliferation and apoptosis of the cells (in comparison with 5-FU (1) and 5-FUrd (2a)) set up priorities in this dissertation. After 24 h, 48 h or 72 h of incubation of HT-29 human colon carcinoma cells with the derivatives 1 (5-FU) (14-23%, 35-46% and 30-58%) or 2a (5-FUrd) (33-45%, 60-67% and 58-67%) the survival of the cells was significantly decreased, in comparison to the negative control. Additionally, after 24 h treatment of the HT-29 cells at concentrations of 40 µm and 80 µm with the derivatives 3a (77% and 95%), 5a (30% and 86%) and 3c (89% and 96%) significantly reduced the viability of the HT-29 cells in comparison to the negative control. These three derivatives showed after 24 h of incubation of HT-29 cells at concentrations of 40 µm and 80 µm a significant reduction of the viability in comparison to the positive control (1) (61-81%, 73% and 80-82%), too. Incubation (48 h) of the HT-29 cells with the derivatives showed that four derivatives at concentrations of 40 µm and 80 µm significantly reduced the viability in comparison to 5-FU (~positive control): at the derivatives 3a (9-54%), 5a (5-48%), 7a (2-30%) and 3c (53-63%). Derivatives 4a and 6a did not affect the viability of the HT-29 cells. The derivatives 3a, 5a, 7a and 3c also showed a significant decrease of viability in other cancer cell lines (RENCA and HepG2): After 48 h of incubation of the RENCA cells, the derivatives 3a (51-57%) and 5a (56%) showed a significant decrease of viability compared to 5-FU. The derivative 3c (38-49%) and 7a (25-44%) revealed similar cytotoxic effects on the viability of RENCA cells like substance 1 (29-48%) and 2a (41-46%). After 48 h incubation of HepG2 cell lines, the derivatives 3a (72-75%), 5a (53%), 7a (43%) and 3c (22-74%) showed a significant decrease of viability in comparison to 5-FU. Investigations of the derivatives using differentiated macrophages (THP1) were of major importance for the discrimination between cytotoxic- and side-effects. The derivative 5a showed a significant 6-27% increase of the viability in comparison to 5-FU (~positive control) after 48 h of incubation. The ATTO 425®-conjugated derivatives 3b, 4b, 5b, 6b and 7b were tested regarding their anticancer activity in human HT-29 cells after 24 h and 48 h of treatment. All of the derivatives lost their anticancer activity after conjugation with ATTO 425® at all concentrations under test (10-80 µm) in comparison to the control. Using concentrations of 10-80 µM only the ATTO 425®-conjugated derivative 5-FUrd (2c) showed a significant 31-52% or 41-57% reductions of the viability in comparison to the control . Furthemore, we tested the impact of the derivatives on induction of apoptosis or proliferation in HT-29 cells after 1 h, 2 h, 4 h or 6 h of incubation in comparison to 5-FU (1) and 5-FUrd (2a). The derivative 5a showed the highest increase of apoptosis at a concentration of 80 µM - after 2 h (3.1-fold), 4 h (3-fold) and 6 h (4-fold). After 6 h of treatment at concentration 40 µM a significant 3.3-fold increased apoptosis rate was observed. Moreover, the effects of the treatment of HT-29 cells with the substances on gene signatures were part of the investigation. In real time PCR (qRT-PCR) the derivative 5a (40 µM) showed a significant 2-fold increase of the tumor suppressor gene p53 expression compared to the negative and positive control (5-FU), and a 1.5-fold increased expression of the proapoptotic Caspase-3 gene. This dissertation shows that the cytotoxicity of several derivatives of 5-FUrd (2a) was more effective than 5-FU, respectively, 5-FUrd using several cancer cell lines. Especially the derivative 5a is of major interest, because it has no cytotoxic effects on differentiated human macrophages (~ immune cell), despite of its high cytotoxic activity on several cancer cell lines. Thus, the derivative 5a could be a novel potential cytotoxic multipotent chemotherapeutic drug. For the final assessment of the pharmacological/therapeutic potential, additional investigations, such as microtumors/-spheres, animal studies, and prospective clinical trials are needed.


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