Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg

Titel: HPLC-Analysen zur Bedeutung genetischer Varianten organischer Kationentransporter für hydrophile kationische Medikamente
Autor: Tadjerpisheh, Sina
Weitere Beteiligte: Keusgen, Michael (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0482
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0482
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-04825
DDC: 610 Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): HPLC analysis for the importance of genetic variants of organic cation transporter for cationic hydrophilic drugs

Dokument

Schlagwörter:
HPLC, organsiche hydrophile Medikamente, Proguanil,Cycloguanil,Amisulprid, Debrisoquin, hplc analysis, proguanil, cycloguanil, amisulpride, debrisoquine

Zusammenfassung:
Die Bedeutung genetischer Variation bei der Biotransformation von Arzneimitteln ist gut bekannt. Es hat sich in den letzten zwei Dekaden gezeigt, dass in den Genen einiger Arzneimittel-Membrantransporter eine erhebliche erbliche Variation besteht. Aus diesem Grunde und wegen der Bedeutung bei Arzneimittel-Interaktionen ist die Erforschung der relevanten Membrantransporter inzwischen zu einem wichtigen Bestandteil der präklinischen und frühen klinischen Arzneimittelentwicklung geworden. Für hydrophobe Arzneistoffe sind Efflux-Transporter wie der Multidrug-Resistance-Proteine 1 (MDR1) von großer Bedeutung. Hinzu kommen für die hydrophilen Arzneistoffe viele Influx-Transporterproteine wie beispielsweise die organischen Kationentransporter (OCTs), die die Aufnahme von organischen kationischen Molekülen in die Zelle beschleunigen. Um bei Transportmessungen Konzentration innerhalb der Zelle zu messen, ist heute neben der immer noch weit verbreiteten Anwendung der radioaktiven Markierungen die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) das am häufigsten verwendete analytische Verfahren. Jedoch lässt sich nicht jede bereits publizierte Methode problemlos auf die vorhandenen Gegebenheiten und Anforderungen bezüglich der Empfindlichkeit übertragen. Daraus ergaben sich die speziellen Herausforderungen der vorliegenden Arbeit. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden folgende Ziele verfolgt: Für Untersuchungen zur Bedeutung organischer Kationentransporter sollte zunächst die Optimierung und Validierung von HPLC-Methoden zur quantitativen Bestimmung der Arzneistoffe Proguanil, Cycloguanil, Amisulprid, Debrisoquin und 4-Hydroxydebrisoquin erfolgen. Die Biochemie der zellulären Aufnahme von Proguanil sowie Cycloguanil sollte geklärt werden. Dies sollte erfolgen anhand von HEK293-Zellen, welche die vermutlich hier relevanten organische Kationentransporter OCT1-3 sowie OCTN1 und OCTN2 exprimierten. Zur weiteren Klärung und Bestätigung sollten auch Experimente mit Inhibition des Transports an den oben erwähnten OCTs durchgeführt werden. Ferner sollten zu Proguanil und Cycloguanil die Auswirkungen der bei Europäern relevanten und natürlicherweise auftretenden Genvarianten und Interaktionen mit weiteren Arzneistoffen auf den 1. Einleitung 34 Membrantransport analysiert werden. Schließlich sollte der Transport von Proguanil durch Erythrozytenmembranen mit anschließender Inhibition des vermeintlichen Transports und der Interaktion mit weiteren Arzneistoffen analysiert werden. Durch die Validierung und Optimierung der HPLC-Methoden konnten die Konzentrationen der Arzneistoffe Proguanil, Cycloguanil, Amisulprid sowie Debrisoquin quantitativ bestimmt werden. Die obigen Arzneistoffe konnten mit der erforderlichen Empfindlichkeit und Präzision gemessen werden Die In-Vitro-Versuche zeigten, dass das Antimalariamittel Proguanil und sein aktiver Metabolit Cycloguanil über die elektrogenen organischen Kationentransporter OCT1, OCT2 und OCT3 mit unterschiedlicher Vmax und KM transportiert werden können. Die organischen Kationentransporter OCTN1 und OCTN2 zeigten hingegen keine Beschleunigung der zellulären Aufnahme der beiden Substanzen. Ausgewählte Polymorphismen des OCT1, die mit einer erhöhten Häufigkeit bei Kaukasiern auftreten und Auswirkungen auf die Aufnahme von anderen Arzneistoffen zeigten, zeigten auch bei Proguanil und Cycloguanil einen veränderten und in der Regel reduzierten Membrantransport. Die gleichzeitige Gabe weiterer Pharmaka (insbesondere Mefloquin, Chinin oder Omeprazolmit unterschiedlichen Konzentrationen führten zu einer Reduktion des Membrantransports von Proguanil und Cycloguanil an OCT1. Der erythrozytäre Transport des Antimalariamittels Proguanil durch die Erythrozytenmembran konnte ebenfalls analysiert werden. Dieser war unter anderem mit L-Carnitin hemmbar und folgt einer Michaelis-Menten-Kinetik. Die Ergebnisse zeigen, dass die organischen Kationentransporter eine bedeutende Rolle bei der Aufnahme und Ausscheidung von Proguanil und Cycloguanil im menschlichen Organismus spielen können.

Summary:
The importance of genomic variation in the biotransformation of drugs is well known. Only in the last two decades, the big importance of drug membrane transporters and of genomic variation in their genes became apparent. For this reason and because of the importance in drug-drug interactions, the identification of the relevant membrane transporters has meanwhile become an essential part of pre-clinical and early clinical drug development. Particularly for hydrophobic drugs the ATP consuming efflux transporters like the multidrug resistance transporter 1 (MDR1) are highly important. In addition to the efflux transporters, there are influx transport proteins which accelerate the uptake of hydrophilic cationic molecules into the cell. One group of these influx transporters are the organic cation transporters (OCTs). In order to measure substrate concentrations in transport experiments within the cell, the analytical method of the high pressure liquid chromatography (HPLC) is the most commonly used procedure alongside to the still widespread use of radioactive labels. However, not every previously published method can be easily transfered to the existing conditions. The specific challenges of this present work resulted from the small volumes and low concentrations to be analyzed in the transport experiments. The thesis had the following objectives: Firstly, the HPLC methods for quantitative analysis of drugs such as proguanil, cycloguanil, amisulpride and debrisoquine for membrane transport experiments should be optimized and validated. The cellular uptake of proguanil and cycloguanil should be measured in HEK293 cells which overexpress the organic cation transporters OCT1, -2, and -3 and OCTN1 and -N2. The data should be further validated by inhibition of the transport using typical inhibitors of OCTs and drugs relevant as comedication. In addition, the impact on the relevant inherited variants of organic cation transporters should be analyzed. Finally, the transport of proguanil into non-infected erythrocytes should be characterized. This should include inhibition experients with prototypical inhibitors of organic cation transporters and with substances relevant as co-medication. 1. Einleitung 36 Based on validation and optimization of HPLC methods, the concentration of the drugs proguanil, cycloguanil, amisulpride and debrisoquine could be determined quantitatively. The drugs were measured and detected in the low nanogram/ml concentration range. In-vitro experiments showed that the antimalarial drug proguanil and its active metabolite cycloguanil can be transported with different maximum transport velocities and affinities by the electrogenic organic cation transporters OCT1, OCT2 and OCT3. In contrast to them, the organic cation transporter OCTN1 and OCTN2 overexpressed in HEK cells didn´t show any increase in the cellular uptake of proguanil and cycloguanil. Selected inherited variants of OCT1 existing in Caucasian populations with a relatively high frequency and differing in their transport functions with many other drug also showed altered uptake of the drug proguanil and its active metabolite cycloguanil here. Coincubation with other drugs or model substrates in different concentrations showed significant reductions in the transport of proguanil and cycloguanil by OCT1. In particular, transport activity was reduced by quinine, mefloquine and omeprazole. A carrier-mediated transport of the antimalarial drug proguanil through the erythrocyte membrane could also be shown. This process could be inhibited and followed a Michaelis-Menten kinetics. Interestingly, the erythrocyte uptake could be inhibited by the OCTN substrate carnitine, a finding which requires further studies considering that overexpression of OCTN1 and OCTN2 in HEK cells did not increase proguanil or cycloguanil uptake. In conclusion, the results showed that the organic cation transporters OCT1, OCT2 and OCT3 may play a role in the absorption and secretion of proguanil and cycloguanil within the human organism.


* Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten