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Titel: Der Insekten-Metalloprotease-Inhibitor IMPI zur Therapie von Wundinfektionen - Präklinische Untersuchungen und Formulierungsdesign
Autor: Eisenhardt, Michaela
Weitere Beteiligte: Keusgen, Michael (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0468
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0468
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-04680
DDC: 500 Naturwissenschaften
Titel(trans.): The Insect-Metalloproteinase-Inhibitor IMPI for the treatment of wound infections - Preclinical investigations and formulation design

Dokument

Schlagwörter:
Wundinfektion, Pseudomonas aeruginosa, Hydrogel, Metalloprotease, Pseudomonas Elastase, Wound infections, Pseudomonas aeruginosa, hydrogel, Metallproteinases, Pseudolysin

Zusammenfassung:
Chronische Wundinfektionen stellen ein weltweites medizinisches Problem mit hoher Prävalenz, gravierenden Folgen für die Patienten und hohen Kosten für das Gesundheitssystem dar. Aufgrund von Resistenzen der verursachenden Keime, fehlen derzeit die therapeutischen Alternativen und nicht selten resultiert eine Sepsis mit hoher Amputations- und Mortalitätsrate. Pseudomonas aeruginosa ist dabei eines der häufigsten und bedeutendsten Bakterien mit hoher Antibiotikaresistenz. Sein Schlüsselvirulenzfaktor, die M4-Metalloprotease (MP) Pseudolysin (PE), ist an der Intoxikation, der Invasion und der Verteilung im Wirt beteiligt. Die Hemmung von Virulenzfaktoren ist ein neuer, vielversprechender Behandlungsansatz. Allerdings wirken MP-Inhibitoren meist unspezifisch und sind für die Therapie weniger geeignet. Der Insekten-Metalloprotease-Inhibitor (IMPI) hingegen zeigte in proteolytischen Aktivitätstests eine effiziente, spezifische Wirkung gegen bakterielle M4-MP, wie z.B. PE. Die Ziele dieser Arbeit waren die pharmakologische Charakterisierung von IMPI und die Entwicklung einer geeigneten Formulierung. Das therapeutische Potenzial von IMPI bei P. aeruginosa Infektionen wurde erstmals auf molekularer, zellulärer und histologischer Ebene bestimmt. Die inhibitorische Kapazität von IMPI-GST gegen PE und das Sekretom, eines aus der Wunde isolierten P. aeruginosa Stammes, wurde in Protease-Tests ermittelt. Im Vergleich zum Referenz-Inhibitor Phosphoramidon (PA) zeigte IMPI-GST eine effizientere Wirkung und einen schnelleren Wirkeintritt. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal das P. aeruginosa Sekretom auf Hautzellen untersucht. Mit steigender Sekretom-Konzentration reduzierte sich die Viabilität der Keratinozyten und nach Applikation von 10% Sekretom wurde ein komplettes Zellsterben festgestellt. Dabei erwies sich die Zellablösung als Hauptursache und damit das Auftreten einer Anoikis. In immunhistologischen Färbungen wurden morphologische Veränderungen des Zytoskeletts bei mit Sekretom behandelten Keratinozyten festgestellt. Aus diesen Ergebnissen und unter Berücksichtigung der Literatur wurde angenommen, dass die Zerstörung von Zellkontakten, die Degradierung von Proteinen der Extrazellulären Matrix sowie der Einfluss auf den MAPK-Signalweg ursächlich für die Anoikis sind. Obwohl die zellbasierten Untersuchungen auf eine multifaktorielle Virulenz des Sekretoms hinweisen, scheint PE dafür hauptverantwortlich zu sein. Die potenzielle Wirkung von IMPI-GST wurde zunächst in vitro und ex vivo ermittelt. IMPI-GST zeigte selbst keinen zytotoxischen Einfluss, verhinderte die Sekretom bedingten Zellablösungen und führte zu einer signifikanten Steigerung der Viabilität um mehr als 60%. Die Migration von Keratinozyten ist ein essentieller Vorgang der Wundheilung und wurde in vitro unter Einfluss des Sekretoms ermittelt. Mit steigender Sekretom-Konzentration verminderte sich die Zellmigration. IMPI-GST führte bei gleichzeitiger Applikation zu einer signifikanten Erhöhung der Migration und verhinderte die Auswirkungen des Sekretoms vollständig. Die Ergebnisse der in vitro Untersuchungen wurden ex vivo in einem Schweinehaut-Wundmodell überprüft. Hierbei bestätigten sich der nekrotische, zellschädigende und heilungsvermindernde Einfluss des Sekretoms sowie die Wirkung von IMPI-GST. Bei gleichzeitiger Applikation von IMPI-GST wurde der vom Sekretom induzierte Gewebeabbau zum Großteil verhindert und eine deutlich verbesserte Wundheilung beobachtet. Der Fokus des zweiten Teils dieser Arbeit lag auf der Entwicklung einer Formulierung zur Anwendung von IMPI bei Wundinfektionen. Dazu wurde ein thermosensitives Hydrogel mit dem Hauptgelbildner Poloxamer 407 designt. Die geeigneten Poloxamere und Additive wurden in Bezug auf ihre Rheologie in oszillatorischen Messungen untersucht. Daraus ergab sich eine Gelzusammensetzung aus 16% P407 mit 15% P188 und 3% Glycerin. Keimbelastungstests beweisen den Einsatz von 0,2% Kaliumsorbat mit 0,1% Zitronensäure als geeignete Konservierungsmittel. Abschließende Aktivitätstests mit der Galenik zeigten keine Beeinträchtigung der Wirkstoff-Aktivität. In einem Franz-Zell-Diffusionsversuch zeigte IMPI-GST eine kontinuierliche Freisetzung über einen Zeitraum von 10 h und IMPI-GST beeinflusste die Rheologie des Gels nicht signifikant. Die vorliegende Arbeit bestätigt das Wirkpotential von IMPI-GST zur Therapie von Infektionen mit P. aeruginosa auf molekularer, zellulärer und histologischer Ebene. Es wurde erstmals der schädigende Einfluss des pathogenen P. aeruginosa Sekretoms auf humanen Keratinozyten und einem Schweinehaut-Wundmodell identifiziert. Die Behandlung mit IMPI-GST verbesserte systematisch in allen in vitro und ex vivo Experimenten deutlich die Viabilität, die Morphologie und die Migrationsfähigkeit sowie insgesamt die Wundheilung. Für die Applikation von IMPI-GST erwies sich das entwickelte thermosensitive Hydrogel als geeignet.

Summary:
Chronic wound infections are a worldwide occurring health care problem with massive consequences for the patient and high costs for the health care system. Due to the frequent antibiotic resistance of pathogenic bacteria the therapeutic options are limited. The Pseudomonas aeruginosa is one of the commonest and most important germs in wounds with high antibiotic resistance. Its key virulence factor, the M4-Metalloproteinase (MP) Pseudolysin (PE), takes part in the intoxication, the invasion and the distribution of the pathogen. The inhibition of virulence factors is a novel promising therapeutic approach, but most of the MP-inhibitors are unspecific and thus unsuitable for the pharmaceutical use. The Insect-Metalloproteinase-Inhibitor (IMPI), however, was proved to be an efficient and highly specific inhibitor against bacterial M4-MP, like PE. The focuses of this thesis research were the pharmacological verification of IMPI and on the development of a suitable formulation for its application in wound infections. For the first time the therapeutic potential of IMPI against infections with P. aeruginosa was investigated on molecular, cellular and histological level. The inhibitory capacity of IMPI-GST was initially tested against pure PE and the secretome of wound isolated P. aeruginosa in proteolytic activity assays. In comparison to the reference inhibitor Phosphoramidon (PA), IMPI-GST was more efficient and showed a narrower active window. In this thesis the P. aeruginosa secretome was studied on skin cells for the first time. A strong decrease in the cell viability was measured due to an increasing secretome concentration and treatment with 10% secretome resulted in complete cell death. This was mainly caused by the detachment of cells from the surface and thus the occurrence of Anoikis. Immunohistochemical stainings of secretome-treated cells showed retraction of F Aktin and morphological changes in the cytoskeleton. Therefore, it was hypothesized that the main reasons are the destruction of cell contacts, like Tight Junctions, Adherence Junctions and Focal Adhesions, the degradation of proteins of the extracellular matrix as well as the influence in the MAPK pathway. Although the cell based examinations suggested a multifactorial virulence of the secretome PE seems to be mainly responsible. Subsequently, the potential pharmaceutic effect of IMPI-GST was examined in vitro and ex vivo. IMPI-GST showed no cytotoxic impact and prevented the secretome-related cell detachment, which resulted in a significant increase in viability of more than 60%. The migration of keratinocytes is an essential process in wound healing. The in vitro cell migration was strongly reduced in accordance to an increased applied secretome concentration. IMPI-GST enhanced the migration and completely prevented the secretome-induced impact on the keratinocytes. Finally, the observed in vitro results were tested in an ex vivo porcine skin wound healing model. Therein the healing diminishing, necrotic and cell destructing effects of the secretome were confirmed. Also, the positive results of the IMPI-GST treatment were proved. The tissue destruction, induced by the secretome, was prevented due to a simultaneous application of IMPI-GST and a clear improvement in wound healing was observed based on a formed wound tongue. The second part of the thesis focused on the formulation development for the application of IMPI-GST in chronic wound infections. Therefore, a thermosensitive hydrogel with the gelling agent Poloxamer 407 was designed. The suitable Poloxamers and additives as well as their appropriate concentrations were investigated in relation to their rheological parameters, elastic and viscous modulus, in oscillatory measurements. This led to a final gel composition of 16% P407, 15% P188 and 3% Glycerin. Germ-contamination-tests approved the use of the preservative combination of 0.2% potassium sorbate with 0.1% citric acid. Final activity assays demonstrated no interference in the inhibitory activity of IMPI-GST with the formulation. In Franz cell diffusion assays IMPI-GST was continuously released out of the hydrogel over a period of 10 h. Furthermore, neither the influence of IMPI-GST on the rheological characteristic of the hydrogel nor any other interaction between the formulation and the active pharmaceutical ingredient was recognized. In conclusion, this study confirms the presumed therapeutic activity of IMPI against infections with P. aeruginosa on molecular, cellular and histological level. The influence of the pathogenic P. aeruginosa secretome on human keratinocytes and a porcine wound model was identified for the first time. An improvement in viability, morphology and migration capacity of the secretome-treated cells as well as wound healing in all in vitro and ex vivo experiments occurred by the application of IMPI-GST. For the use of this active peptide IMPI a thermosensitive hydrogel was developed.


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