Der Insekten-Metalloprotease-Inhibitor IMPI zur Therapie von Wundinfektionen - Präklinische Untersuchungen und Formulierungsdesign

Chronische Wundinfektionen stellen ein weltweites medizinisches Problem mit hoher Prävalenz, gravierenden Folgen für die Patienten und hohen Kosten für das Gesundheitssystem dar. Aufgrund von Resistenzen der verursachenden Keime, fehlen derzeit die therapeutischen Alternativen und nicht selten resul...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Eisenhardt, Michaela
Beteiligte: Keusgen, Michael (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2016
Pharmazeutische Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Chronische Wundinfektionen stellen ein weltweites medizinisches Problem mit hoher Prävalenz, gravierenden Folgen für die Patienten und hohen Kosten für das Gesundheitssystem dar. Aufgrund von Resistenzen der verursachenden Keime, fehlen derzeit die therapeutischen Alternativen und nicht selten resultiert eine Sepsis mit hoher Amputations- und Mortalitätsrate. Pseudomonas aeruginosa ist dabei eines der häufigsten und bedeutendsten Bakterien mit hoher Antibiotikaresistenz. Sein Schlüsselvirulenzfaktor, die M4-Metalloprotease (MP) Pseudolysin (PE), ist an der Intoxikation, der Invasion und der Verteilung im Wirt beteiligt. Die Hemmung von Virulenzfaktoren ist ein neuer, vielversprechender Behandlungsansatz. Allerdings wirken MP-Inhibitoren meist unspezifisch und sind für die Therapie weniger geeignet. Der Insekten-Metalloprotease-Inhibitor (IMPI) hingegen zeigte in proteolytischen Aktivitätstests eine effiziente, spezifische Wirkung gegen bakterielle M4-MP, wie z.B. PE. Die Ziele dieser Arbeit waren die pharmakologische Charakterisierung von IMPI und die Entwicklung einer geeigneten Formulierung. Das therapeutische Potenzial von IMPI bei P. aeruginosa Infektionen wurde erstmals auf molekularer, zellulärer und histologischer Ebene bestimmt. Die inhibitorische Kapazität von IMPI-GST gegen PE und das Sekretom, eines aus der Wunde isolierten P. aeruginosa Stammes, wurde in Protease-Tests ermittelt. Im Vergleich zum Referenz-Inhibitor Phosphoramidon (PA) zeigte IMPI-GST eine effizientere Wirkung und einen schnelleren Wirkeintritt. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal das P. aeruginosa Sekretom auf Hautzellen untersucht. Mit steigender Sekretom-Konzentration reduzierte sich die Viabilität der Keratinozyten und nach Applikation von 10% Sekretom wurde ein komplettes Zellsterben festgestellt. Dabei erwies sich die Zellablösung als Hauptursache und damit das Auftreten einer Anoikis. In immunhistologischen Färbungen wurden morphologische Veränderungen des Zytoskeletts bei mit Sekretom behandelten Keratinozyten festgestellt. Aus diesen Ergebnissen und unter Berücksichtigung der Literatur wurde angenommen, dass die Zerstörung von Zellkontakten, die Degradierung von Proteinen der Extrazellulären Matrix sowie der Einfluss auf den MAPK-Signalweg ursächlich für die Anoikis sind. Obwohl die zellbasierten Untersuchungen auf eine multifaktorielle Virulenz des Sekretoms hinweisen, scheint PE dafür hauptverantwortlich zu sein. Die potenzielle Wirkung von IMPI-GST wurde zunächst in vitro und ex vivo ermittelt. IMPI-GST zeigte selbst keinen zytotoxischen Einfluss, verhinderte die Sekretom bedingten Zellablösungen und führte zu einer signifikanten Steigerung der Viabilität um mehr als 60%. Die Migration von Keratinozyten ist ein essentieller Vorgang der Wundheilung und wurde in vitro unter Einfluss des Sekretoms ermittelt. Mit steigender Sekretom-Konzentration verminderte sich die Zellmigration. IMPI-GST führte bei gleichzeitiger Applikation zu einer signifikanten Erhöhung der Migration und verhinderte die Auswirkungen des Sekretoms vollständig. Die Ergebnisse der in vitro Untersuchungen wurden ex vivo in einem Schweinehaut-Wundmodell überprüft. Hierbei bestätigten sich der nekrotische, zellschädigende und heilungsvermindernde Einfluss des Sekretoms sowie die Wirkung von IMPI-GST. Bei gleichzeitiger Applikation von IMPI-GST wurde der vom Sekretom induzierte Gewebeabbau zum Großteil verhindert und eine deutlich verbesserte Wundheilung beobachtet. Der Fokus des zweiten Teils dieser Arbeit lag auf der Entwicklung einer Formulierung zur Anwendung von IMPI bei Wundinfektionen. Dazu wurde ein thermosensitives Hydrogel mit dem Hauptgelbildner Poloxamer 407 designt. Die geeigneten Poloxamere und Additive wurden in Bezug auf ihre Rheologie in oszillatorischen Messungen untersucht. Daraus ergab sich eine Gelzusammensetzung aus 16% P407 mit 15% P188 und 3% Glycerin. Keimbelastungstests beweisen den Einsatz von 0,2% Kaliumsorbat mit 0,1% Zitronensäure als geeignete Konservierungsmittel. Abschließende Aktivitätstests mit der Galenik zeigten keine Beeinträchtigung der Wirkstoff-Aktivität. In einem Franz-Zell-Diffusionsversuch zeigte IMPI-GST eine kontinuierliche Freisetzung über einen Zeitraum von 10 h und IMPI-GST beeinflusste die Rheologie des Gels nicht signifikant. Die vorliegende Arbeit bestätigt das Wirkpotential von IMPI-GST zur Therapie von Infektionen mit P. aeruginosa auf molekularer, zellulärer und histologischer Ebene. Es wurde erstmals der schädigende Einfluss des pathogenen P. aeruginosa Sekretoms auf humanen Keratinozyten und einem Schweinehaut-Wundmodell identifiziert. Die Behandlung mit IMPI-GST verbesserte systematisch in allen in vitro und ex vivo Experimenten deutlich die Viabilität, die Morphologie und die Migrationsfähigkeit sowie insgesamt die Wundheilung. Für die Applikation von IMPI-GST erwies sich das entwickelte thermosensitive Hydrogel als geeignet.
Beschreibung:147 pages.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2016.0468