Dokument

Zusammenfassung:
Der Intrinsic Coagulation Activity Assay (INCA) ist ein neuer chromogener Globaltest für die intrinsische Blutgerinnung. Bisher ist die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) der am weitesten verbreitete Test zur Messung der intrinsischen Gerinnung, obgleich bekannt ist, dass die aPTT nicht in der Lage ist, das volle Spektrum der Gerinnungsaktivierung wiederzugeben, d. h. eine ausgeglichene Gerinnungsaktivität einerseits und prothrombotische oder antikoagulatorische Zustände andererseits klar als solche zu erkennen. Die aPTT eignet sich dazu, die Therapie mit unfraktioniertem Heparin zu überwachen, während sie für die Therapieüberwachung vieler anderer Antikoagulanzien nicht geeignet ist. Neue chromogene und fluorogene Thrombingenerierungsteste wurden entwickelt, konnten gewisse Probleme jedoch nicht überzeugend lösen: das Problem der Fibrinbildung, die Interferenz der Kontaktaktivierung und den Bedarf an spezieller Computersoftware und Fluorometer im Falle der fluorogenen Methoden. Darüber hinaus wurden alle diese Teste zur Messung der extrinsischen Gerinnung entwickelt. Die zunehmende Evidenz für die Bedeutung der Kontaktfaktoren für die pathologische Thrombusbildung und für prothrombotische Krankheitsbilder unterstreicht unterdessen den Bedarf an einem neuen sensitiven Test zur intrinsischen Gerinnung. Der INCA misst die Thrombinaktivität in internationalen Einheiten (IU) unter Verwendung eines chromogenen Peptidsubstrats und eines Photometers. INCA beinhaltet zwei Reaktionen, welche getrennt voneinander ablaufen: Zuerst startet die Gerinnungsreaktion durch Inkubation von 50 μl Zitratplasma mit 5 μl SiO2 (Pathromtin® SL) und 250 mmol/l CaCl2 in Polystyrol-F-wells bei 37 °C in einem digital kontrollierten Wasserbad. Um den wichtigsten Teil einer Thrombingenerierungskurve zu erstellen, wird die Reaktion sodann nach vier bzw. fünf Minuten Gerinnungsreaktionszeit (GRZ) durch Zugabe von 100 μl 2.5 mol/l Arginin, pH 8.6, welches die Gerinnung inhibiert und Fibrin depolymerisiert, gestoppt. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei Raumtemperatur werden 50 μl 1 mmol/l chromogenes Peptidsubstrat CHG-Ala-Arg-pNA in 1.25 mol/l Arginin, pH 8.7, zugefügt (finale Konzentration 0.24 mmol/l), um die Nachweisreaktion zu starten. Das chromogene Substrat wird von Thrombin gespalten und setzt pNA frei. In einem Mikrotiterplattenphotometer wird der Absorptionsunterschied (ΔA) bei 405 nm registriert. Zur Kalibrierung dient ein Standard, welcher 1 IU/ml Thrombin enthält. INCA gemessen nach vier und fünf Minuten GRZ (INCA-4 und INCA-5) liefert die zur Beurteilung einer Plasmaprobe nötige Information, vorausgesetzt, dass der Quotient INCA-5/INCA-4 größer als eins ist. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die normale Thrombinaktivität von INCA-4 (Hauptwert) ca. 0.5 IU/ml (= 100% der Norm) und von INCA-5 (Kontrollwert) ca. 1.9 IU/ml (= 100% der Norm) beträgt. Wie durch die Messung von 39 Plasmen gesunder erwachsener Spender ermittelt wurde, ist der Normbereich 100% ± 30% (Durchschnitt ± Standardabweichung). Die 10-fach-Bestimmung eines frischen Normalplasmapools ergab einen intra-assay bzw. inter-assay Variationskoeffizienten von < 10% bzw. < 15%. Die Analyse von 173 Patientenplasmen zeigte, dass der Durchschnittswert für INCA-4 bei Patienten mit verlängerter aPTT oder erhöhter International Normalized Ratio (INR) ca. 10% der INCA-4-Aktivität von nicht antikoagulierten Patienten beträgt. Der Unterschied in den INCA-4-Mittelwerten der Gruppen „verlängerte aPTT“ und „erhöhte INR“ jeweils im Vergleich zu den Nicht-Antikoagulierten war statistisch signifikant, was darauf hindeutet, dass der Effekt von Heparin und Cumarinderivaten von INCA erfasst wird. Die Korrelation von INCA-Aktivitäten mit der aPTT oder der INR zeigen einen schwachen bis mäßigen negativen Zusammenhang. INCA ist sehr empfindlich in Bezug auf Veränderungen der Plasmamatrix, so dass eine Verdünnung des Aktivators zu falsch-hohen INCA-Werten führt. Auch das präanalytische Einfrieren und Auftauen von Plasma erhöht den INCA-4-Wert. Aufgrund von drei Eigenheiten des INCA, nämlich dem Einsatz von Arginin zur Hämostasestabilisierung und Fibrindepolymerisierung, der geringen Aktivatorkonzentration (weniger als 5% der Kontaktaktivatormenge der aPTT) und dem schnell reagierenden chromogenen Substrat, ist der INCA sehr empfindlich. Durch zukünftige Forschung ist zu klären, ob der INCA als Screeningtest für Funktionsstörungen im intrinsischen Gerinnungssystem geeignet ist und ob er dazu beitragen kann, die Therapieüberwachung von verschiedenartigen Antikoagulanzien zu verbessern. Wenn sich dies bestätigt, könnte INCA ein wertvolles diagnostisches Instrument in den Gerinnungslaboren werden, welches möglicherweise in der Lage wäre, die Lücke in der Gerinnungsanalyse des intrinsischen Systems zu schließen.

Bibliographie / References

1. Arakawa H, Nishigai M, Ikai A (1989): α2-Macroglobulin traps a proteinase in the midregion of its arms. An immunoelectron microscopic study. J Biol Chem 5(264):2350-2356
2. Barthels M, Bergmann F, Czwalinna A (2012): Aktivierte partielle Thromboplstinzeit (aPTT). In: Barthels M (Hrsg.): Das Gerinnungskompendium. 2. Aufl. Georg Thieme Verlag, Stuttgart New York, 371-386
3. Appleton J (2002): Arginine: Clinical potential of a semi-essential amino acid. Altern Med Rev 7(6):512-522
4. Becker U, Jering H, Bartl K, Jilek F (1984): Automated prothrombin-time test with use of a chromogenic peptide substrate and a centrifugal analyzer. Clin Chem 30(4):524-528
5. Butenas S, Mann KG (2007): Caution in the interpretation of continuous thrombin generation assays. J Thromb Haemost 5:1084-1085
6. Becker U, Bartl K, Lill H, Wahlefeld AW (1985): Development of a photometric assay for activated partial thromboplastin time and its application to the Cobas Bio centrifugal analyzer. Thromb Res 40(6):721-730
7. Calatzis AN, Kling M, Calatzis AL, et al. (1996): Fast and specific coagulation monitoring through modified thrombelastography. Ann Hematol 72(1):92
8. Bloemen S, Hemker HC, Al Dieri R (2013 b): Large inter-individual variation of the pharmacodynamic effect of anticoagulant drugs on thrombin generation. Haematologica 98(4):549-554
9. Cate H ten (2013): New oral anticoagulants: discussion on monitoring and adherence should start now! Thromb J 11(1):8
10. Cimmino G, Golino P (2013): Platelet biology and receptor pathways. J Cardiovasc Transl Res 6(3):299-309
11. Bosch Y, Al Dieri R, ten Cate H, Nelemans P, Bloemen S, Hemker C, Weerwind P, Maessen J, Mochtar B (2013): Preoperative thrombin generation is predictive for the risk of blood loss after cardiac surgery: a research article. J Cardiothorac Surg 8:154
12. Bode W (2006): Structure and interaction modes of thrombin. Blood Cells Mol Dis 36(2):122-130
13. Baglin T (2005): The measurement and application of thrombin generation. Br J Haematol 130:653-661
14. Brummel-Ziedins K, Vossen CY, Rosendaal FR, Umezaki K, Mann KG (2005): The plasma hemostatic proteome: thrombin generation in healthy individuals. J Thromb Haemost 3(7):1472-1481
15. Clements JA, Willemsen NM, Myers SA, Dong Y (2004): The tissue kallikrein family of serine proteases: functional roles in human disease and potential as clinical biomarkers. Crit Rev Clin Lab Sci 41(3):265-312
16. Brummel KE, Paradis SG, Butenas S, Mann KG (2002): Thrombin functions during tissue factor-induced blood coagulation. Blood 100(1):148-152
17. Castoldi E, Rosing J (2011): Thrombin generation tests. Thromb Res. 127 Suppl 3:21- 25
18. Al Dieri R, de Laat B, Hemker HC (2012): Thrombin generation: What have we learned? Blood Rev 26(5):197-203
19. Broze GJ Jr. (1995): Tissue factor pathway inhibitor and the revised theory of coagulation. Annu Rev Med 46:103-12
20. Preissner KT (2010): Vitamin-K-abhängige Gerinnungsfaktoren. In: Pötzsch B, Madlener K (Hrsg.): Hämostaseologie. 2. Aufl. Springer, Berlin Heidelberg New York, 159-168
21. Bloemen S, de Laat M, de Laat B, Hemker HC, Al Dieri R (2013 a): Will One Size of Anticoagulant Dosage Fit All? Drug development research 74:406-412

Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten