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Titel: Pan-archaeal analysis of C/D box sRNA biogenesis and methylation targets
Autor: Tripp, Vanessa
Weitere Beteiligte: Randau, Lennart (Dr. rer. nat.)
Erscheinungsjahr: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0222
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0222
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-02225
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Archaeen-übergreifende Analyse der C/D box sRNA Biogenese und der Methylierungsziele

Dokument

Schlagwörter:
Archaebakterien, RNS, C/D box sRNA, posttranskriptionale Modifikationen, RNA Methylierung, ribosomale RNA, RNA-Seq, Archaea, RNA, RNA methylation, posttranscriptional modification

Summary:
Post-transcriptional modifications of RNA molecules occur in all three domains of life and influence RNA stability and functionality. The most numerous modifications are 2'-O-methylations at the ribose moiety and pseudouridylations. In archaea, modified bases are abundant in ribosomal RNAs (rRNAs) and transfer RNAs (tRNAs). The introduction of both modifications is guided by small RNAs that are incorporated into ribonucleoprotein complexes (RNPs). 2'-O-methylations are guided by C/D box sRNAs in archaea. C/D box sRNAs are characterized by the conserved sequence elements boxC/C' (consensus sequence: RUGAUGA) and boxD/D' (consensus sequence: CUGA). Upon C/D box sRNA folding, both sequence elements base-pair (boxC with boxD and boxC' with boxD'), which results in the formation of two kink-turn motifs that are stabilized by binding of the protein L7Ae. The sequences between the two kink-turn elements show complementarity to the sequences of the target RNA and thereby serve as guide sequences that determine the sites of 2'-O-methylation. The modifications are introduced site-specifically at the nucleotide of the target RNA that is complementary to the fifth nucleotide upstream of the boxD/D' motif by the methyltransferase fibrillarin. Based on the guide sequences, C/D box sRNA targets of seven archaea were predicted and mapped onto the consensus structure of the 16S and 23S rRNA. Conserved methylation hotspots were observed in ancient core regions of the rRNAs that are important for ribosome integrity and functionality and that are not protected by ribosomal proteins. Therefore, the modifications might contribute to the folding, structural stabilization and function of the rRNAs. The biogenesis of archaeal C/D box sRNAs is largely unknown as independent promoters cannot be identified for the majority of the C/D box sRNA genes. The analysis of C/D box sRNA genes in six archaeal model organisms revealed diverse genetic contexts, providing opportunities for transcription without the necessity of an independent promoter. C/D box sRNA genes localize e.g. in the 5' or 3'-UTR of flanking protein-coding regions and polycistronic C/D box sRNA transcripts exist. Plasmid-based C/D box sRNA in vivo analyses were performed in Sulfolobus acidocaldarius in which C/D box sRNA genes variants with their native or random upstream and downstream sequences were used to identify C/D box sRNA stabilization and maturation requirements. The analyses revealed that the maturation of C/D box sRNAs occurs independently of the upstream and downstream sequences. The integrity of the k-turn is important for C/D box sRNA stability. Archaeal C/D box sRNAs exhibit a transcriptional plasticity and their maturation is suggested to include the action of unspecific exoribonucleases. Complete degradation might be prevented by co-transcriptional L7Ae binding or complete C/D box sRNP assembly. Circular forms of the C/D box sRNAs were identified in several hyperthermophilic archaea and the circularization reaction should protect RNAs from degradation. C/D box sRNA gene upstream and downstream sequences were shown not to be required for circularization but the responsible RNA ligase remains to be identified. Thus, this thesis provides insights into the transcription and maturation of archaeal C/D box sRNAs and highlights conserved 2'-O-methylation pattern in archaeal rRNAs.

Zusammenfassung:
Posttranskriptionale Modifikationen sind in RNA Molekülen von allen drei Domänen des Lebens zu finden und sie beeinflussen die Stabilität und Funktionalität der RNAs. Die häufigsten Modifikationen sind 2'-O-Methylierungen der Ribose oder Pseudouridylierungen. In Archaeen kommen sie am häufigsten in ribosomalen RNAs (rRNAs) und Transfer-RNAs (tRNAs) vor. Die Position in der diese Modifikationen eingefügt werden, wird durch kleine RNAs bestimmt die an einen Ribonukleoproteinkomplex (RNP) gebunden sind. Für die Positionsbestimmung der 2'-O-Methylierungen in den Ziel-RNAs sind in Archaeen C/D box sRNAs zuständig. Charakteristische Sequenzmotive der C/D box sRNAs sind die BoxC/C' (Konsensussequenz: RUGAUGA) und BoxD/D' (Konsensussequenz: CUGA). Während der C/D box sRNA Faltung bilden diese Motive Basenpaare (BoxC mit BoxD sowie BoxC' mit BoxD') und dadurch entstehen zwei Kink-turn Motive, die durch die Bindung von L7Ae stabilisiert werden. Die Sequenzen zwischen den BoxC und BoxD' bzw. BoxC' und BoxD Motiven weisen Komplementarität zu den Sequenzen der Ziel-RNA auf und dadurch bestimmen sie das Ribonukleotid an dem die Ribose 2'-O-methyliert wird. Das Ribonukleotid der Ziel-RNA, das komplementär zum fünften Ribonukleotid stromaufwärts der BoxD/D' Motive ist, wird durch die Methyltransferase Fibrillarin modifiziert. Basierend auf den zur Ziel-RNA komplementären Bereichen, wurden die C/D box sRNA Ziele von sieben Archaeen vorhergesagt und in den Konsensusstrukturen der 16S und 23S rRNA gekennzeichnet. Konservierte Methylierungshotspots wurden in evolutionär ursprünglichen Kernregionen der rRNAs gefunden, die wichtig für den Ribosomenaufbau und die Ribosomenfunktionalität sind und nicht von ribosomalen Proteinen geschützt werden. Deshalb könnten die Modifikationen zur Faltung, Stabilisierung von Sekundärstrukturen sowie der Funktion der rRNA beitragen. In Archaeen ist die Biogenese der C/D box sRNAs weitgehend unbekannt, da für die Mehrheit der C/D box sRNA Gene keine eigenen Promotoren identifiziert werden konnten. Die Analyse des genomischen Kontexts von C/D box sRNA Genen in diversen Archaeen hat gezeigt, dass dieser sehr unterschiedlich sein kann. Es wurden verschiedene C/D box sRNA Gen Lokalisierungen gefunden, bei denen die Transkription ohne das Vorhandensein eines eigenen Promotors möglich ist. Es konnten z.B. C/D box sRNA Gene identifiziert werden die in 5' oder 3'-UTRs von flankierenden protein-codierenden Bereichen liegen sowie Cluster von mehreren C/D box sRNA Genen, die polycistronisch transkribiert werden. Um die C/D box sRNA Stabilisierungs- und Reifungs-Voraussetzungen zu identifizieren, wurden Plasmid-basierte in vivo Analysen in Sulfolobus acidocaldarius durchgeführt, wobei C/D box sRNA Gen Varianten mit den nativen oder beliebigen stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Sequenzen genutzt wurden. Die Analysen haben gezeigt, dass die Reifung der C/D box sRNAs unabhängig von den stromaufwärts oder stromabwärts gelegenen Sequenzen ist. Die Integrität des k-turns ist wichtig für die C/D box sRNA Stabilität. C/D box sRNAs weisen eine transkriptionale Plastizität auf und die Reifung der RNAs scheint die Aktivität von unspezifischen Exoribonukleasen einzuschließen. Die vollständige Degradation der C/D box sRNAs könnte durch die co-transkriptionale Assemblierung von L7Ae oder des kompletten C/D box sRNPs verhindert werden. In verschiedenen hyperthermophilen Archaeen kommen zudem zirkuläre Formen der C/D box sRNAs vor, die wahrscheinlich einen Schutz vor Degradation darstellen. Es konnte gezeigt werden, dass die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Sequenzen der C/D box sRNA Gene für die Zirkularisierung nicht relevant sind, allerdings muss die für die Zirkularisierung zuständige Ligase noch identifiziert werden. Somit liefert diese Arbeit Einblicke in die Transkription und Reifung von C/D box sRNAs in Archaeen und zeigt, dass konservierte 2'-O-Methylierungsmuster in rRNAs von Archaeen existieren.


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