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Titel: Hinweise für die funktionelle und dynamische Mikrokompartimentierung von Caveolin-1, TRPV4 und Calcium-aktivierten Kaliumkanälen in den Caveolae von Endothelzellen
Autor: Goedicke-Fritz, Sybelle
Weitere Beteiligte: Hoyer, Joachim (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0170
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0170
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-01703
DDC: Medizin, Gesundheit
Titel(trans.): Evidence for functional and dynamic microcompartmentation of Cav-1/TRPV4/K(Ca) in caveolae of endothelial cells

Dokument

Schlagwörter:
Caveolae, KCa2.3, KCa3.1, Caveolae, TRPV4, KCa3.1, Ca2+-aktivierte K+-Kanäle, calcium channel, potassium channel, TRPV4, Ionenkanal, Kaliumkanal, Calciumkanal, KCa2.3, Endothelzelle

Zusammenfassung:
Noch immer zählen kardiovaskuläre Erkrankungen zu den häufigsten Todesursachen weltweit. Besonders die arterielle Hypertonie stellt nach wie vor einen Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen dar. So geht Bluthochdruck stets mit einer endothelialen Dysfunktion, Athero- und Arteriosklerose, und pathologischen Gefäßveränderungen einher. Zur Regulation des Blutdruckes setzt das Endothel vasodilatatorische und vasokonstriktorische Faktoren frei und beeinflusst so den Kontraktionszustand der glatten Muskulatur. Zu den am längsten bekannten endothelabhängigen Vasodilatatoren gehören Prostazyklin (PGI2) und Stickstoffmonoxid (NO). Neben ihnen besitzt das Endothel ein drittes gefäßerweiterndes System, den endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF). Während die Funktionen des endothelialen NO und des PGI2 für die lokale und systemische Blutdruckregulation heut zu Tage weitestgehend bekannt sind, sind die biologischen Mechanismen und Signaltransduktionskaskaden des EDHF noch nicht vollständig geklärt. Insbesondere Ca2+-aktivierte K+-Kanäle, zu denen KCa2.3 und KCa3.1 zählen, spielen eine entscheidende Rolle in der endothelabhängigen Hyperpolarisation und in der Regulation des Gefäßtonus und des Blutdruckes. Die Aktivierung dieser beiden KCa-Kanäle beruht auf einem Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration, die weitestgehend durch Ca2+- durchlässige Kationenkanäle, einschließlich dem transient receptor potential V4 (TRPV4), vermittelt werden. Es wir vermutet, dass KCa-Kanäle und Ca2+-durchlässige Kationenkanäle räumlich assoziiert sind, eine funktionelle Einheit bilden und die Caveolae der Zellmembran hier als Mikrokompartimente dienen. Caveolae können als mikroskopisch kleine, sackförmige Einstülpungen an der Oberfläche vieler Säugerzelltypen beobachtet werden. Sie haben eine einzigartige Lipidzusammensetzung und werden wegen ihres hohen Gehalts an Cholesterin und Sphingolipiden zu den „Lipid Rafts“ gezählt. Die Caveolae sind an zahlreichen zellulären und physiologischen Prozessen beteiligt, z.B. Endozytose, Transzytose, Fettstoffwechsel, Virus-Wirt-Interaktion, Krebs und Signaltransduktion. Das integrale Membranprotein Caveolin-1 stellt das Hauptstrukturprotein der Caveolae dar. Die vorliegende Arbeit hat sich mit der Frage beschäftigt, ob die endothelialen KCa-Kanäle KCa2.3 und KCa3.1 und der Ca2+-durchlässige Kationenkanäle TRPV4 in den Caveolae angereichert sind und welchen Effekt ein Fehlen von Caveolin-1, dem Strukturprotein der Caveolae, in vivo auf die genannten KCa-Ströme hat. Es konnte gezeigt werden, dass TRPV4 und KCa2.3 in den Caveolae humaner mikrovaskulärer Endothelzellen (HMEC-1) angereichert sind. Mit Hilfe von Immunpräzipitations-Studien und immunzytologischen Untersuchungen sowie hochauflösender Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass in humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC-1) unter statischen Bedingungen eine physikalisch und Caveolae-abhängige Assoziation zwischen Caveolin-1, TRPV4 und dem KCa2.3 aber nicht mit KCa3.1 besteht. Zudem konnten wir eine Interaktion und Kolokalisation zwischen TRPV4 und KCa2.3 beobachten. Schließlich konnten wir nach Applikation laminarer Schubspannung eine de novo Kolokalisation von KCa3.1/Caveolin-1 und KCa3.1/TRPV4 nachweisen. Anhand von Patch-Clamp Versuchen an frisch isolierten Endothelzellen der Arteria carotis communis von Caveolin-1-defizienten Mäusen konnte eine 45 %-ige Reduktion der KCa-vermittelten Kaliumströme im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen gezeigt werden (-54 % für KCa2.3 und -40 % für KCa3.1). Zusammenfassend liefert die vorliegende Arbeit Hinweise für eine dynamische Mikrokompartimentierung von TRPV4/KCa in Caveolae von Endothelzellen und zeigt die Bedeutung des Caveolin-1 für die endothelialen KCa -Funktionen.  

Summary:
Cardiovascular diseases are the major cause of death worldwide. Especially arterial hypertension contributes as a risk factor for cardiovascular diseases. Hypertension is often associated with endothelial dysfunction, athero- and arteriosclerosis, and pathological vascular remodeling. For blood pressure regulation, the endothelium releases relaxing and contracting factors and thereby adjusts smooth muscle contractility. Prostacyclin (PGI2) and nitric oxide (NO) were the earliest identified endothelium-dependent vasodilators. Next to them, the endothelium possess a third vasodilator system, the endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF). While the role of endothelial NO and PGI2 for local and systemic blood pressure control is well established, the nature of EDHF and EDHF-signalling pathways is not fully understood. However, Ca2+-activated K+ channels (KCa) play a pivitol role in the endothelium-dependent hyperpolarization and regulation of vascular tone and blood pressure. For activation, KCa depend on an increase of intracellular calcium which is substantially mediated by Ca2+-permeable cation channels including the transient receptor potential V4 (TRPV4). It has been proposed that KCa- and Ca2+-permeable cation channels may be spatially associated to form functional units, and caveolae of the cell membrane have been suggested as possible scaffolds for such microcompartmental organization. Caveolae are small, omega-shaped membrane invaginations present on the surface of many mammalian cell types. They are enriched in cholesterol and sphingolipids and therefore represent lipid-raft microdomains. Caveolae function in a variety of cellular and physiological processes including endocytosis, transcytosis, lipid regulation, signaling, pathogen entry and cancer. Caveolin-1, an integral membrane protein, is the major coat protein of caveolae. In this study we asked the question whether endothelial KCa and TRPV4 are enriched in caveolae and whether deletion of caveolin 1 (Caveolin-1), the major structural protein of caveolae, affects KCa-currents in vivo. We show that TRPV4 and small-conductance KCa2.3 are enriched in caveolae of human microvascular endothelial cells. Using immunoprecipitation, immunocytology and superresolution microscopy, we found that a close and caveolae-dependent association exists between caveolin-1, TRPV4 and small conductance KCa2.3, but not intermediate conductance KCa3.1, in endothelial cells under static condition. Also we could show an interaction und colocalization between KCa2.3 and TRPV4. Mechanical stimulation of cells via exposure to continuous shear stress led to a de-novo colocalization of KCa3.1 with Caveolin-1 and TRPV4. Patch-Clamp measurements of freshly isolated carotid artery endothelial cells (CAEC) from Caveolin-1-/- mice demonstrated a ~ 45 % reduction of KCa-mediated potassium currents (-54 % for KCa2.3 and -40 % for KCa3.1) when compared to wildtype controls. In summary, present work provide evidence for a dynamic microcompartimentation of TRPV4/KCa in caveolae of endothelial cells and highlight the importance of Caveolin-1 for endothelial KCa functions.


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