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Titel: Comprehensive analysis of peptidoglycan hydrolases in Caulobacter crescentus
Autor: Zielinska, Aleksandra
Weitere Beteiligte: Thanbichler, Martin (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0118
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0118
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-01187
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Umfassende Analyse der Peptidoglucan-Hydrolasen in Caulobacter crescentus

Dokument

Schlagwörter:
Peptidoglucan, Zellwand, Hydrolasen, Caulobacter, peptidoglycan, hydrolase, Caulobacter

Summary:
The peptidoglycan (PG) sacculus is a large macromolecule enclosing most bacterial cells. During progression of the cell cycle, it needs to be continuously remodelled to enable elongation of the cell body and, finally, cell division. This process requires a delicate balance between synthetic and hydrolytic reactions, which are executed by an array of different enzymes. However, the roles of individual components in this complex machinery and the mechanisms underlying their temporal and spatial regulation are still incompletely understood. In particular, the functional significance of many PG hydrolases is still unclear. While acting at all stages of cell wall biogenesis, PG hydrolases have a particularly important role during cell division, facilitating the coordinated invagination of the PG layer as constriction proceeds. Previous work has identified the putative PG hydrolase DipM as a key component of the Caulobacter crescentus divisome. However, the extent to which other hydrolases contribute to PG remodelling during the constriction process in this species has remained unknown. To identify the major players and elucidate their function, I have analysed the full set of putative amidases, lytic transglycosylases (LTs), endopeptidases (EPases) and LD-transpeptidases (LD-TPases) encoded in the C. crescentus genome. For this purpose, I generated a variety of fluorescent fusions and deletion mutants and characterized them using microscopic and biochemical approaches. The results obtained indicate that the PG hydrolases of C. crescentus have highly redundant functions. Based on the observation of changes in cell morphology, localization dynamics, stress and antibiotic resistance I have identified a particularly important role of EPases in maintaining cell wall integrity. Deletion of the amiC and chap genes encoding proteins with PG amidase activity had no detectable effect. In contrast, mutants lacking multiple EPases of the NlpC/P60 or LytM subgroups formed either long smooth filaments or occasionally cell chains. Furthermore, the presence of either NlpC/P60 domain containing EPase NlpA, or the Chap amidase is essential to maintain proper growth. Inactivation of all soluble lytic transglycosylases (SLTs), led to cell filamentation accompanied by outer-membrane blebbing. Depletion of DipM, an EPase homologue lacking catalytic activity in strains lacking either all SLTs or all of the remaining LytM factors (a subgroup of EPases), led to a complete block in cell division and finally to cell death. Interestingly, a similar morphological defect was observed upon depletion of a DipM in a strain lacking another LytM factor with degenerated active site, LdpF. Cultivation in stress conditions revealed critical functions of LdpF, SdpA (falling into the SLTs group) and Chap in cell envelope biogenesis, since single deletions of the respective genes led to either osmo- or antibiotic sensitivity. Moreover, SdpA displayed a dynamic localization pattern, characteristic for the divisome components implicated in the final stages of cell wall remodelling, indication a role in the cell division. Collectively, this work provides the first comprehensive analysis of PG hydrolases in C. crescentus and underscores the key role of the catalytically inactive EPase homologues DipM and LdpF in the autolytic system of this species.

Zusammenfassung:
Der Peptidoglucan-Sacculus ist ein (einzelnes) großes Makromolekül, welches die meisten bakteriellen Zellen umhüllt. Während des Zellzyklus muss dieser kontinuierlich remodelliert werden, um den Elongationsprozess und letztlich auch die Zellteilung zu ermöglichen. Dieser Prozess benötigt ein empfindliches Gleichgewicht aus synthetischen und hydrolythischen Reaktionen, welche von einer Vielzahl an verschiedenen Enzymen durchgeführt werden. Jedoch sind die Aufgaben der einzelnen Komponenten dieser komplexen Maschinerie, noch deren zeitliche und räumliche Regulation bisher vollständig aufgeklärt. Insbesonders die Funktion und die Signifikanz der meisten PG-Hydrolasen ist noch weitgehend unbekannt. Während PG-Hydrolasen in allen Phasen der Zellwand-Biogenese beteiligt sind, besitzen sie eine besonders wichtige Rolle während der Zellteilung, bei der sie die streng regulierte Invagination der Zellwand, während des Abschnürprozesses, ermöglichen. Frühere Arbeiten identifizierten das PG-Hydrolase Homolog DipM als eine Schlüsselkomponente des Caulobacter crescentus Divisoms. Indes ist der Umfang, in dem Hydrolasen an der PG-Remodelierung bei dieser Spezies beitragen, noch unklar. Um die zentralen Faktoren zu identifizieren und ihre Funktion zu beleuchten, wurden in dieser Arbeit alle Amidasen, lytische Transglycosylasen (LTasen), Endopeptidasen (EPasen) und LD-Transpeptidasen (LD-TPasen) die im Genom von C. crescentus kodiert sind, analysiert. Dazu generierte ich eine Vielzahl an Fluoreszenzfusionen und Deletionsmutanten und analysierte diese mit mikroskopischen und biochemischen Methoden. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse zeigten, dass die PG-Hydrolasen von C. crescentus hochgradig redundante Funktionen aufweisen. Basierend auf der Analyse der Zellmorphologien, Lokalisierungsdynamiken, Stress- und Antibiotika-Resistenz, konnte eine besonders wichtige Rolle der EPasen bei der Sicherstellung des korrekten Zellwachstums identifiziert werden. Die Deletion der amiC- und chap-Gene, welche Proteine mit Amidase-Aktivität kodieren, hatten keinerlei Effekt. Im Gegensatz dazu bildeten Mutanten mit multiplen Deletionen in EPase Genen, welche in die NlpC/P60- oder LytM-Familie fallen, lange glatte Filamente und gelegentlich Zellketten. Darüber hinaus ist die NlpC/P60 artige EPase NlpA zusammen mit Chap Amidasen redundant essentiell für das Zellwachstum. Eine Inaktivierung aller löslichen lytischen Transglycosylasen (SLTasen) führt zu einer Filamentierung zusammen mit der Bildung von Membranvesikeln. Depletion von DipM in Stämmen, in denen die SLTasen oder die verbleibenden LytM-Faktoren deletiert worden waren, führt zu einem kompletten Stillstand der Zellteilung und schließlich zum Zelltod. Interessanterweise wurde ein ähnlicher Phänotyp, auch bei Depletion von DipM in Zellen erhalten, denen die katalytisch inaktive EPase LdpF, fehlt. Eine Kultivierung unter Stress-Bedingungen zeigte eine eindeutige Funktion von LdpF, SdpA (einer SLTasen) und Chap bei der Zellhüllen-Biogenese, denn Deletionen in den entsprechenden Genen führten einerseits zu einer Osmo- oder Antibiotika-Sensitivität. Ferner zeigt SdpA ein dynamisches, Zellzyklus abhängiges Lokalisierungmuster, das dem von Divisom-assoziierten Proteinen entspricht, die an den finalen Schritten der Zellwandremodellierung beteiligt sind, was eine Funktion bei der Zellteilung unterstützt. Insgesamt stellt diese Arbeit die erste Umfassende Analyse von PG-Hydrolasen von C. crescentus dar und unterstreicht die Schlüsselfunktionder katalytisch inaktiven EPase-Homologe DipM und LdpF im autolytischen System in diesem Organismus.


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