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Titel: Regulation by cyclic di-GMP in Myxococcus xanthus
Autor: Skotnicka, Dorota
Weitere Beteiligte: Søgaard-Andersen, Lotte (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0101
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0101
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-01015
DDC: Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Regulation durch cyclisches-di-GMP in Myxococcus xanthus

Dokument

Schlagwörter:
cyclic di-GMP, Myxococcus xanthus, Exopolysaccharide, diguanylate cyclase, Myxococcus xanthus, cyclisches-di-GMP, exopolysaccharide, Diguanylatzyklase

Summary:
The nucleotide-based second messenger bis-(3’-5’)-cyclic dimeric GMP (c-di-GMP) is involved in regulating a plethora of processes in bacteria that are typically associated with lifestyle changes. Myxococcus xanthus undergoes major lifestyle changes in response to nutrient availability with the formation of spreading colonies in the presence of nutrients and spore-filled fruiting bodies in the absence of nutrients. Here, we investigated the function of c-di-GMP in M. xanthus. We show that this bacterium synthesizes c-di-GMP. Manipulation of the cellular c-di-GMP level by expression of either an active, heterologous diguanylate cyclase or an active, heterologous phosphodiesterase in vegetative cells caused defects in type IV pili (T4P)-dependent motility whereas gliding motility was unaffected. An increased level of c-di-GMP caused reduced transcription of the pilA gene that encodes the major pilin of T4P, reduced assembly of T4P and altered cell agglutination whereas a decreased level of c-di-GMP caused altered cell agglutination. The systematic inactivation of the 24 genes in M. xanthus encoding proteins containing GGDEF, EAL or HD-GYP domains, which are associated with c-di-GMP synthesis, degradation or binding, identified three genes encoding proteins important for T4P-dependent motility. These three proteins named DmxA, TmoK and SgmT all contain a GGDEF domain. Purified DmxA had diguanylate cyclase activity whereas the TmoK and SgmT (both hybrid histidine protein kinases) did not have diguanylate cyclase activity. During starvation, the c-di-GMP level in M. xanthus increases significantly. Manipulation of this level revealed that a low c-di-GMP level negatively affects the developmental program while an increased level does not interfere with development. Moreover, among the 24 genes encoding proteins containing GGDEF, EAL or HD-GYP domains, we identified two which are specifically involved in development: pmxA and dmxB. pmxA codes for an enzymatically active phosphodiesterase with an HD-GYP domain. dmxB codes for a developmentally induced, enzymatically active diguanylate cyclase. DmxB is essential for the increased c-di-GMP level and regulates exopolysaccharide accumulation during starvation. Our results show that c-di-GMP acts as an important signaling molecule during M. xanthus development, and suggest a model in which a minimal threshold level of c-di-GMP is essential for the successful progression and completion of the developmental program. Additionally, candidates for c-di-GMP effectors in M. xanthus were identified using a capture compound mass spectrometry approach. Some of the candidates were confirmed to bind c-di-GMP in vitro and deletion mutants for genes encoding those proteins were characterized in terms of T4P-dependent motility and development.

Zusammenfassung:
Der nukleotid-basierte, sekundäre Botenstoff bis-(3‘-5‘)-cyclic GMP (c-di-GMP) ist an einer Vielzahl von regulatorischen Prozessen im Zusammenhang mit Veränderungen des Lebenszyklusses in Bakterien beteiligt. Myxococcus xanthus reagiert entsprechend der Nährstoffverfügbarkeit in seiner Umgebung. Bei ausreichenden Nährstoffen bildet M. xanthus sich ausbreitende Kolonien. Unter nahrungslimitierenden Bedingungen hingegen werden mit Sporen gefüllte Fruchtkörper geformt. In dieser Arbeit wurde die Funktion von c-di-GMP in M. xanthus untersucht. M. xanthus kann c-di-GMP produzieren. Die Manipulation der zellulären c-di-GMP Konzentration durch Expression einer heterologen, aktiven Diguanylatzyklase oder Phosphodiesterase in lebenden Zellen führte zu einem Defekt der „type-IV-pili“ (T4P) abhängigen Beweglichkeit. Die Gleitbewegung von M. xanthus hingegen blieb dadurch unberührt. Eine erhöhte Konzentration von c-di-GMP reduzierte die Transkription des pilA Genes, welches für das wichtigste Pilin des T4P codiert, reduzierte das Vorkommen von T4P generell und veränderte die Zellagglutination. Ein niedriges Niveau von c-di-GMP führte lediglich zu veränderter Zellagglutination. Die systematische Inaktivierung von 24 Genen in M. xanthus, welche für Proteine mit GGDEF, EAL oder HD-GYP Domänen kodieren, die im Zusammenhang mit der Synthetisierung, dem Abbau oder dem Binden von c-di-GMP stehen, identifizierte drei Gene, die wichtig für die T4P abhängige Bewegung sind. Die dazugehörigen Proteine DmxA, TmoK und SgmT enthalten alle eine GGDEF Domäne. DmxA besitzt Diguanylatzyklaseaktivität, TmoK und SgmT (beide Hybrid Histidinkinasen) zeigen keine Diguanylatzyklaseaktivität in vitro. Die Konzentration von c-di-GMP steigt während nahrungslimitierenden Bedingungen signifikant an. Artifiziell herbeigeführtes niedriges c-di-GMP Niveau beeinflusst das Entwicklungsprogramm, hohes jedoch nicht. Zudem konnten wir aus den 24 Genen, die für Proteine mit GGDEF, EAL und HD-GYP Domänen kodieren, zwei Gene identifizieren, welche spezifisch im Entwicklungsprogramm von M. xanthus involviert sind: pmxA und dmxB. pmxA kodiert für eine enzymatisch aktive Phosphodiesterase mit einer HD-GYP-Domäne. dmxB kodiert für eine im Entwicklungsprogramm induzierte, enzymatisch aktive Diguanylatzyklase. DmxB ist essentiell um ein erhöhtes c-di-GMP Niveau in den Zellen aufrechtzuerhalten und reguliert außerdem Exopolysaccharide während des Nährstoffmangels. Unsere Resultate zeigen, dass c-di-GMP ein wichtiges Signalmolekül im Entwicklungsprogramm von M. xanthus ist und weist auf ein Model hin, in dem ein minimaler Schwellenwert an c-di-GMP Konzentration erreicht sein muss, um ein erfolgreiches Fortschreiten des Entwicklungsprogrammes zu gewährleisten. Zusätzlich konnten wir c-di-GMP spezifische Effektormoleküle mit Hilfe von Massenspektrometrie identifizieren und teilweise charakterisieren. Für einige dieser Kandidaten konnte bestätigt werden, dass sie in vitro c-di-GMP binden und die Deletionsmutanten der korrespodierenden Gene wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit des T4P abhängigen Beweglichkeit und ihres Entwicklungsprogrammes charakterisiert.


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