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Titel: Voltage-dependence of adrenoceptor activity : Mechanisms and signal transduction
Autor: Birk, Alexandra Christine
Weitere Beteiligte: Bünemann, Moritz (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2016
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0081
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0081
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-00817
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Spannungsabhängigkeit der Aktivität von Adrenozeptoren : Mechanismen und Signaltransduktion

Dokument

Schlagwörter:
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer, G Protein-gekoppelte Rezeptoren, Adrenozeptoren, Spannungsabhängigkeit, Gs Protein, Spannungssensor, intrinsische Aktivität, voltage-dependence, affinity, efficacy, mechanism of voltage-dependence

Summary:
G protein-coupled receptors comprise a large superfamily of membrane proteins which transmit extracellular stimuli into intracellular responses. Adrenoceptors (AR) belong to the α-group of Rhodopsin-family G protein-coupled receptors. Physiological activation of adrenoceptors is mediated by binding of the endogenous catecholamines noradrenaline and adrenaline and leads to the regulation of neuronal, endocrine, cardiovascular, vegetative and metabolic functions. In addition to the classical activation of GPCRs by binding of ligands, experimental evidence has accumulated showing that GPCR activation can be modulated by the membrane potential. In this study adrenoceptors β1-AR and β2-AR have been investigated in regard to the modulation of their activity by the membrane potential. Both receptors couple to the stimulatory Gs protein. They were used as model receptors because despite increasing knowledge of voltage-dependent regulation of Gi- and Gq-coupled receptor activity, no data has been published on the voltage-sensitivity of Gs-coupled receptors. Förster resonance energy transfer (FRET)-based assays were combined with whole-cell patch-clamp in a voltage-clamp mode in order to monitor agonist- and voltage-dependent alterations in either protein conformation or protein-protein interaction. Conformational changes of the receptor molecule upon stimulation with catecholamines in the presence or absence of depolarizing steps were directly monitored using FRET-based intramolecular receptor fusion proteins. By means of the combination of FRET and patch-clamp, voltage-dependence of β1-AR and to smaller extent β2-AR activation was shown to be an intrinsic property of these Gs-coupled receptors and was transmitted to downstream signaling. Receptor activity and downstream signaling decreased during depolarization. This expands voltage-dependent GPCRs to the group that couple to stimulatory G proteins. Voltage-dependence of β1-AR was mainly mediated via an alteration in efficacy of either Iso or Adr and occurred with highest sensitivity at physiological membrane potentials. Regarding Adr this is a unique finding since voltage-dependence of other GPCRs activated by their endogenous ligands were shown to rely on alterations in ligand affinity. Agonist-specificity of voltage-dependence was also apparent as dopamine-induced β1-AR interaction with arrestin 3 was enhanced during depolarization whereas it was reduced when induced by adrenaline, isoprenaline, noradrenaline or dobutamine. A different binding mode of dopamine might be responsible for these differences. The second part of this thesis focused on the molecular mechanism underlying voltage-dependence. Mutation of a charged amino acid and a residue involved in agonist binding did not seem to alter voltage-dependence or only yielded inconclusive results. However, the introduction of an additional positive charge in the vicinity of a highly conserved aspartic acid in TM2 (D2.50) reduced voltage-dependence of the mutant receptor. We might have identified this aspartic acid as one residue of a voltage-sensor in α2A-AR but further experiments are required in order to corroborate this hypothesis. Taken together these data expand voltage-dependent GPCRs to the group coupling to Gs proteins. Especially in excitable tissue like the heart, which expresses voltage-dependent β1-AR the membrane potential could fine-tune adrenoceptor signaling on a time scale within cardiac action potentials and in the presence of endogenous or synthetic catecholamines. On a molecular level we suggest a possible involvement of the highly conserved aspartic acid D2.50 in the detection of alterations in the membrane potential in α2A-AR. Whether this conclusion is also transferable to other G protein-coupled receptors remains to be investigated.

Zusammenfassung:
G Protein-gekoppelte Rezeptoren bilden eine Superfamilie von Membranproteinen, die extrazelluläre Stimuli ins Zellinnere weiterleiten. Adrenozeptoren (AR) sind G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die der α-Untergruppe der Rhodopsin-Familie angehören. Die endogenen Katecholamine Noradrenalin und Adrenalin führen über die Aktivierung von Adrenozeptoren zur Regulation verschiedenster neuronaler, endokriner, kardiovaskulärer, vegetativer und metabolischer Funktionen. Zusätzlich zur klassischen Aktivierung von GPCRs durch Agonistenbindung an einen Rezeptor konnte die Regulation der Aktivität durch eine Veränderung des Membranpotentials für eine Reihe Gi- und Gq-gekoppelter Rezeptoren gezeigt werden. Zu Beginn dieser Arbeit war jedoch noch keine Untersuchung zur Spannungsabhängigkeit Gs-gekoppelter Rezeptoren beschrieben. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Aktivität der Gs Protein-gekoppelten Adrenozeptoren β1-AR und β2-AR hinsichtlich ihrer Modulation durch das Membranpotential untersucht. Die Kombination Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-basierter Messungen und der patch-clamp Methode im voltage-clamp Modus ermöglichte die Aufzeichnung agonist- und spannungsabhängiger Änderungen von Proteinkonformationen oder von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Es wurden intramolekulare FRET-basierte Rezeptor-Fusionsproteine eingesetzt, um den Einfluss des Membranpotentials auf Bewegungen im aktivierten Rezeptormolekül direkt zu untersuchen. Für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen kamen intermolekulare FRET-Sensoren zum Einsatz. Mithilfe der Kombination aus FRET und elektrophysiologischen Messungen konnte in dieser Arbeit die Spannungsabhängigkeit des β1-AR gezeigt werden, die sich in einer Aktivitätsabnahme bei Depolarisation äußerte. Auch der eng verwandte β2-AR zeigte eine depolarisationsabhängige Abnahme der Aktivität, jedoch war diese schwächer ausgeprägt als bei β1-AR. Die Spannungsabhängigkeit übertrug sich für beide Rezeptoren auch auf die nachgeschaltete Signalkaskade. Diese Ergebnisse erweitern den Kreis spannungsabhängiger Rezeptoren um die Gruppe Gs-gekoppelter Rezeptoren. Im Falle des β1-AR wurde die Spannungsabhängigkeit hauptsächlich über eine Änderung der intrinsischen Aktivität der Agonisten Isoprenalin und Adrenalin vermittelt. Dies ist erstaunlich, da bisher die Spannungsabhängigkeit von Rezeptoren, die durch endogene Agonisten aktiviert wurden, nur eine Regulation der Agonistaffinität bekannt war. Es konnte ebenfalls eine agonistspezifische Komponente der β1-AR Spannungsabhängigkeit ermittelt werden: Mit Dopamin aktivierte Rezeptoren zeigten eine Zunahme ihrer Aktivität während der Depolarisation während die Isoprenalin-, Noradrenalin-, Adrenalin- und Dobutamin-vermittelte Aktivität bei positiven Membranpotentialen abnahm. Der entgegengesetzten Spannungsabhängigkeit von Dopamin-aktivierten Rezeptoren könnte ein geändertes Bindungsverhalten von Dopamin in der Rezeptorbindetasche zugrunde liegen. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung des molekularen Mechanismus, der der Spannungsabhängigkeit zugrunde liegt. Hierfür wurden verschiedene Aminosäuren im spannungsabhängigen α2A-AR mutiert. Die Neutralisation einer geladenen Aminosäure und der Änderung einer Aminosäure, die an der Agonistbindung beteiligt ist, schienen die Spannungsabhängigkeit nicht zu beeinflussen. Jedoch führte das Einbringen einer zusätzlichen, positiven Ladung in die Nähe des hochkonservierten Aspartats D2.50 in TM2 zu einer Reduktion der Spannungsabhängigkeit. Diese Aminosäure könnte eine Komponente des Spannungssensors des α2A-AR sein, jedoch sind weitere Experimente nötig, um diese Hypothese zu untermauern. Zusammengefasst erweitern die in dieser Arbeit vorgestellten Daten die Gruppe der spannungsabhängigen GPCR um jene, die ihr Signal über stimulatorische Gs-Proteine vermitteln. Besonders in erregbaren Geweben wie dem Herzen, das β1-AR exprimiert, könnte das Membranpotential für eine zusätzliche Feinregulation der Rezeptoraktivität sorgen. Dies könnte sich im zeitlichen Rahmen kardialer Aktionspotentiale abspielen und ohne die Dissoziation des Agonisten vor sich gehen. Auf molekularer Ebene ist eine Beteiligung des hochkonservierten Aspartats in TM2 (D2.50) an der Erkennung von Spannungsänderungen der Plasmamembran im α2A-AR denkbar. Ob sich dies auch auf andere spannungsabhängige GPCRs übertragen lässt, bleibt zu ermitteln.


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