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Titel: Funktionelle Analyse und Dynamik der regulatorischen Schaltkreise des TEA-Transkriptionsfaktors Tec1 in Saccharomyces cerevisiae
Autor: Weisser, Sarah
Weitere Beteiligte: Mösch, Hans-Ulrich (Prof. Dr.)
Erscheinungsjahr: 2017
URI: https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2016/0054
DOI: https://doi.org/10.17192/z2016.0054
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2016-00549
DDC: 570 Biowissenschaften, Biologie
Titel(trans.): Functional analysis and dynamics of the regulatory circuits of the TEA family transcription factor Tec1 in Saccharomyces cerevisiae

Dokument

Schlagwörter:
Saccharomyces cerevisiae, Transkription, Genregulation, Promotor <Genetik>, Biologie, Genetik, Transkriptionsfaktor, MAPK-Signalweg, transcription, gene regulation, promoter, transcription factor, MAPK pathway

Zusammenfassung:
Haploide Zellen der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae können abhängig von Umwelteinflüssen die beiden Differenzierungsprogramme Konjugation und adhäsives Wachstum ausführen. An dieser Regulation ist das hochkonservierte Fus3/Kss1-MAPK Modul beteiligt, welches die beiden Transkriptionsfaktoren Ste12 und Tec1 kontrolliert. Unter Konjugationsbedingungen wird das Adhäsions-spezifische Tec1 abgebaut, um eine ungewollte Aktivierung von Zielgenen der Adhäsion während der Konjugation zu verhindern. Jedoch finden sich in der Promotorregion von TEC1, neben Tec1-spezifischen Bindestellen (TCS-Elemente; „TEA/ATTS consensus sequence“) auch mögliche Bindestellen für Se12 (PREs; „pheromone response elements“), die vermuten lassen, dass der TEC1-Promotor direkt durch Ste12 gebunden wird und die TEC1-Expression entgegen den Erwartungen unter Konjugationsbedingungen induziert wird. In der vorliegenden Arbeit sollte daher die transkriptionelle und translationelle Regulation von Tec1 insbesondere durch Ste12 näher beleuchtet werden. Zunächst wurde untersucht, welche Rolle die Autoregulation und die Regulation durch Ste12 bei der Kontrolle der TEC1-Expression während verschiedener Differenzierungsprogramme spielen und ob ausgewählte Umweltsignale selektiv über einen bestimmten Regelkreis verarbeitet werden. Hier konnte gezeigt werden, dass die Expression von TEC1 unter vegetativen und Konjugationsbedingungen hauptsächlich durch Ste12 über die PREs vermittelt wird, während die TCS-Elemente für eine effiziente Transkription nicht benötigt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die TEC1-Expression und Proteinstabilität durch verschiedene Nährstoffsignale beeinflusst wird. Ein Mangel an Glukose führte beispielweise zu erhöhten TEC1-Transkript- und Tec1-Proteinmengen, während Stickstoffmangel nur die TEC1-Transkription leicht induziert, die Tec1-Proteinstabilität aber negativ beeinflusst wird. Dabei zeigte sich auch, dass diese Nährstoffkontrolle vermutlich nicht über den TCS- oder PRE-vermittelten Regelkreis erfolgt, sondern über bislang noch unbekannte Mechanismen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der 3‘ untranslatierte Bereich (UTR, „untranslated region“) von TEC1 vermutlich wichtig für die Kontrolle der TEC1-Translation durch das RNA-Bindeprotein Mpt5 zu sein scheint. Der dritte Teil der Arbeit beschreibt die erfolgreiche Entkopplung der TEC1-Expression von der Ste12-vermittelten Kontrolle durch eine synthetische, Doxyzyklin-vermittelte Kontrolle der Transkription. Es konnte gezeigt werden, dass die Ste12-Kontrolle der TEC1-Expression durch eine einzelne Bindestelle für einen Doxyzyklin-regulierten Aktivator ersetzt werden kann. Zudem zeigte sich, dass der aus dem humanen Cytomegalievirus stammende Promotor in S. cerevisiae vermutlich nicht effizient genug aktiviert wird, um eine für die Aktivierung der TEC1-Expression ausreichende Menge an Doxyzyklin-reguliertem Aktivator zu produzieren.

Summary:
Haploid cells of the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae can execute the two developmental programs mating and adhesive growth depending on environmental influences. The highly conserved Fus3/Kss1-MAPK module is involved in this regulation and controls the two transcription factors Tec1 and Ste12. During mating, the adhesion-specific Tec1 is degraded to prevent an undesired activation of target genes of adhesion during mating. However, the promoter of TEC1 contains, amongst Tec1-specific binding sites (TCS-elements; TEA/ATTS consensus sequence) also potential binding sites for Ste12 (PREs; pheromone response elements) suggesting that the TEC1-promoter is directly bound by Ste12 and the TEC1-transcription is induced during mating contrary to the expectations. Therefore, the transcriptional and translational regulation of Tec1 particularly by Ste12 was investigated in the work presented here. First, the role of the autoregulation and the regulation by Ste12 in control of TEC1-expression during different developmental programs was analyzed and it was determined, if exclusive environmental signals are selectively processed by a specific regulatory circuit. Here it could be shown that the expression of TEC1 during vegetative growth and mating is mainly controlled by Ste12 via the PREs whereas the TCS-elements are not required for an efficient transcription. Moreover, it could be shown that the TEC1-expression and protein stability is influenced by different nutritional signals. A lack of glucose for example led to increased TEC1-transcript and Tec1-protein levels, whereas nitrogen deprivation seemed to only slightly induce TEC1-transcription but Tec1-protein stability is negatively influenced. Here it was also shown that the control by nutrients is probably not processed by the TCS- or PRE-mediated regulatory circuit but by so far unknown mechanisms. In the second part of this study it could be shown that the 3’ untranslated region (UTR) of TEC1 is probably important for control of TEC1-translation by the RNA-binding protein Mpt5. The third part of this work describes the successful uncoupling of TEC1-expression from Ste12-mediated control by synthetic doxycycline-mediated control of transcription. It was shown that the control of TEC1-expression by Ste12 can be replaced by a single binding site for a doxycycline-regulated activator. Additionally, it was found that the promoter of the human cytomegalovirus is presumably not efficiently activated in S. cerevisiae to produce a sufficient amount of doxycycline-regulated activator which can subsequently activate TEC1-expression.


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