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Titel:Die Rolle von SCAMP Proteinen beim intrazellulären Transport des Kaliumkanals TASK-1
Autor:Kling, Stefan
Weitere Beteiligte: Daut, Jürgen (Prof. Dr. Dr.)
Veröffentlicht:2015
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2015/0546
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2015-05466
DOI: https://doi.org/10.17192/z2015.0546
DDC: Medizin
Titel (trans.):The role of SCAMP proteins during intracellular transport of potassium channel TASK-1
Publikationsdatum:2016-04-14
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
endocytosis, Endocytose, TASK-1, K2P-Kanäle, SCAMP, SCAMP, K2P channels, TASK-1, Kaliumkanal

Zusammenfassung:
TASK-1 (TWIK-related Acid-Sensitive K+ channel 1) ist ein säuresensitiver K+ Kanal und gehört zu der Familie der K2P-Kanäle (Kaliumkanäle mit zwei Porendomänen). TASK-1 wird in Neuronen, Herzmuskelzellen, glatten Muskelzellen und zahlreichen anderen Zellen exprimiert. In diesen Zellen besitzt TASK-1 eine wichtige Rolle bei der Regulation ihrer Erregbarkeit. Sowohl die transkriptionelle als auch die posttranslationale Regulation von TASK-1 bestimmen die Anzahl der Kanäle auf der Zellmembran und damit direkt den durch TASK-1 vermittelten Strom. Die Regulation der Oberflächenexpression von TASK-1 hat demnach direkten Einfluss auf die elektrophysiologischen Eigenschaften einer Zelle. Die Menge eines Membranproteins an der Zelloberfläche wird im Wesentlichen von zwei Faktoren bestimmt: (1) von dem Vorwärtstransport und (2) von der Endozytose der Zellmembran. Der Vorwärtstransport („forward trafficking“) bezeichnet den Transport von Transmembranproteinen vom rauen endoplasmatischen Retikulum (rER) zum Golgi-Komplex und weiter zur Zellmembran. Die Aufnahme von Proteinen aus der Zellmembran ins Zellinnere wird Endozytose genannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Split-Ubiquitin basierter Hefe-Zwei-Hybrid-Screen mit einer cDNS-Bibliothek aus dem Gehirn durchgeführt, wobei TASK-1 als „Köder“-Protein verwendet wurde. Wir identifizierten Secretory Carrier Membrane Protein 5 (SCAMP5) als neuen Interaktionspartner („Beute“) für TASK-1. Dieses Protein, SCAMP5, gehört zur Familie der „Secretory Carrier Membrane Proteins“. Die strukturellen Gemeinsamkeiten der Proteine dieser Familie sind die vier Transmembran-Domänen (TMD), ein E-Peptid und eine Prolin reiche Sequenz im N Terminus. Die Mitglieder SCAMP1, SCAMP2 und SCAMP3 besitzen in ihrem N Terminus drei NPF-Domänen. Die NPF-Domänen bestehen aus den Aminosäuren Asparagin-Prolin-Phenylalanin und sind in der Lage an EH-Domänen (Epsin Homologe Domänen) zu binden, während SCAMP4 und SCAMP5 nur einen kurzen N-Terminus besitzen, der keine NPF-Domänen enthält. SCAMP5 wird vorwiegend im neuronalen Gewebe exprimiert, im Gegensatz dazu zeichnen sich die anderen Mitglieder der Familie durch eine ubiquitäre Expression aus. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe elektrophysiologischer Messungen gezeigt, dass bei Koexpression von TASK-1 mit SCAMP5, SCAMP1 oder SCAMP2 der durch TASK-1 Kanäle fließende Strom deutlich reduziert wird. Die Oberflächenexpression von TASK-1 wurde mittels eines auf der extrazellulären Seite zugänglichen Hämagglutinin-Motivs (HA-Tag) durch einen luminometrischen Oberflächenassay gemessen. Es zeigte sich, dass bei einer Koexpression der SCAMPs mit TASK 1 die Anzahl der Kanäle auf der Zellmembran deutlich reduziert wird. Die Entfernung der NPF-Domänen im N-Terminus von SCAMP1 und SCAMP2 führen zu einer deutlichen Erhöhung des TASK-1 induzierten Stroms sowie zu einer erhöhten Oberflächenexpression der Kanäle im Vergleich zur Koexpression mit den Wildtypen von SCAMP1 oder SCAMP2. Die Clathrin-vermittelte Endozytose wurde gezielt inhibiert um zu zeigen, dass die Verringerung der Oberflächenexpression auf eine erhöhte Endozytoserate zurückzuführen ist. Sowohl der chemische Blocker Dynasore als auch die Koexpression des dominant-negativen Adapterproteins AP180C konnten den Effekt der SCAMP Proteine auf den TASK-1 induzierten Strom in Oozyten aufheben. Interessanterweise konnte mit der Hefe-Zwei-Hybrid Methode eine direkte Interaktion ausschließlich zwischen TASK-1 und SCAMP5, aber nicht zwischen TASK-1 und SCAMP1 und auch nicht zwischen TASK-1 und SCAMP2 nachgewiesen werden. In der Fluoreszenzmikroskopie zeigte sich, dass eine Kolokalisation an der Zellmembran nur zwischen TASK-1 und SCAMP5 stattfand. Die direkte Quantifizierung der Endozytoserate erfolgte mit dem Antikörper-Aufnahme-Assay. Nach 30 min wurde eine signifikante Internalisierung von TASK-1 bei Kotransfektion mit SCAMP5 beobachtet, jedoch nicht nach einer Kotransfektion mit SCAMP1 oder SCAMP2. Proteinbiochemische Analysen (Histidin Pull-Down Assay) zeigten, dass SCAMP5 sowohl Homomere (wahrscheinlich Homodimere) als auch Heteromere mit SCAMP1 oder SCAMP2 bilden kann. Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass SCAMP1 und SCAMP2 nur indirekt über das Adapterprotein SCAMP5 einen Effekt auf TASK-1 ausüben. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Secretory Carrier Membrane Proteine eine entscheidende Rolle bei der Clathrinvermittelten Endozytose von TASK-1 spielen.


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