Dokument

Zusammenfassung:
Das Ebolavirus ist ein humanpathogenes RNA-Virus, das bei Menschen und Primaten hämorrhagisches Fieber mit Letalitätsraten von bis zu 90% auslösen kann. Das Virus tritt in Form von unvorhersehbaren, sporadischen Ausbrüchen v.a. in Afrika auf und rückte aufgrund des bisher dramatischsten Ausbruches (seit 2013/2014) mit bisher über 28 000 Fällen (davon ca. 11 000 Todesfälle) stärker in das öffentliche Interesse.Das Virus besteht aus einem negativ orientierten Einzelstrang-RNA-Genom mit sieben proteinkodierenden Genen. Für die Replikation des viralen Genoms sind drei dieser Proteine notwendig: die RNA-abhängige RNA-Polymerase (L), das virale Protein 35 (VP35) und das Nukleoprotein (NP). Für die Transkription wird zusätzlich das virale Protein 30 (VP30) benötigt. Über Phosphorylierung von zwei Serin-Clustern in der N-proximalen Region von VP30 wird dessen Aktivität als Transkriptionsfaktor maßgeblich reguliert; im dephosphorylierten Zustand fungiert es als Transkriptionsfaktor und geht eine Interaktion mit VP35 ein, während es im phosphorylierten Status als inaktiver Transkriptionsfaktor den Kontakt zu VP35 verliert und mit dem Nukleoprotein interagiert. Als Folge wechselt die RNA-Polymerase in den replikativen Modus. Die strikte VP30-Abhängigkeit der Transkription wird durch eine stabile Haarnadelstruktur auf dem Genom/Antigenom (nt 56-78) vermittelt und kann durch eine eingeführte strukturelle Schwächung aufgehoben werden. VP30 ist ein RNA-bindendes Protein, das als Hexamer, bestehend aus drei Dimeren, vorliegt und ein unkonventionelles Zinkfinger-Motiv (Cys3His) besitzt. Außerdem fungiert es neben VP35 und VP40 als suppressor of RNA silencing. Zentraler Ansatzpunkt dieser Arbeit war es die RNA-Bindungsfähigkeit von VP30 im Hinblick auf seine Funktion als Transkriptionsfaktor zu untersuchen. Daraus ergaben sich vier Teilprojekte: (i) die Etablierung eines in vitro Assays zu Analyse von RNA:VP30-Komplexen,(ii) die Charakterisierung der RNA-Bindungseigenschaften von VP30, (iii) der Nachweis eines möglichen Zusammenhangs zwischen Transkriptionsaktivierung und RNA-Bindung von VP30 und (iv) eine Transkriptomanalyse zum Verständnis der transkriptionellen Regulation durch VP30. Die Untersuchungen der RNA:VP30-Bindung basierten in erster Linie auf einer modifizierten Variante des EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay), anhand derer unter nativen Bedingungen Affinitäten (in Form von apparenten Kd-Werten) und verschiedene Komplexpopulationen untersucht werden konnten. Die Ergebnisse der Untersuchungen zu den RNA-Bindungseigenschaften von VP30 ließen darauf schließen, dass die VP30:RNA-Wechselwirkung stark elektrostatisch geprägt ist und vornehmlich mit einzelsträngigen RNASubstraten stattfindet. Einen erheblichen Einfluss auf die Bindungsaffinitäten hatte die Länge der einzelsträngigen Bereiche, wobei ein Affinitätsoptimum bei ca. 37 Nukleotiden beobachtet wurde. Im viralen Kontext wurden die 3´-terminalen ca. 150 Nukleotide des Genoms sowie die entsprechend komplementäre Sequenz des Antigenoms zunächst auf potenzielle Strukturelemente hin untersucht und anschließend einer Deletionsanalyse unterzogen. Hierbei bestätigte sich die Präferenz für ungepaarte RNA-Bereiche, wobei der Haarnadelstruktur (nt 56-78) eine affinitätssteigernde Wirkung zugewiesen werden konnte. Zusätzlich wurde gezeigt, dass eine 5´-Kappe am viralen mRNA-Substrat die Bindungsaffinität deutlich im Vergleich zu 5´-Mono- und 5´-Triphosphat-Enden verschlechterte. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen RNA-Bindung und Transkriptionsaktivierung von VP30 nachzuweisen, wurden die transkriptionsinaktiven Varianten VP30_DD (imitiert phosphoryliertes VP30), VP30_5LA (Hexamerisierungs-defekt) und VP30_C72S (mutiertes Zinkfinger-Motiv) sowie die transkriptionsaktive Variante VP30_AA (imitiert dephosphoryliertes VP30) und der Wildtyp von VP30 rekombinant hergestellt und mittels EMSA auf ihre RNA-Bindungsfähigkeit getestet. Hierbei konnte für die Varianten VP30_5LA und VP30_C72S - im Einklang mit ihrer Transkriptionsinaktivität - nur noch eine basale RNA:VP30-Komplexbildung nachgewiesen werden. Auch die beiden Gegenstücke VP30_AA und VP30_DD zeigten RNA-Bindungsaffinitäten, die sich schlüssig zu ihren Transkriptionsdaten verhielten: VP30_AA (transkriptionsaktiv) bindet die RNA 4.3-fach affiner als VP30_DD (transkriptionsinaktiv). Das die beiden Serin-Cluster überlagernde Arginin-Cluster wurde anhand von drei Einzelmutanten (VP30_R26A, _R28A und _R40A) sowie einer Tripelmutante (VP30_3RA) bezüglich RNA-Bindungsfähigkeit und Transkriptionsaktivierung untersucht. Hierbei wurde beobachtet, dass die Einzelmutanten weder RNA-Bindung noch Transkriptionsaktivierung signifikant beeinflussten. Lediglich die Tripelmutante zeigte eine 2-fache Verschlechterung der RNA-Bindung, einen veränderten Bindungsmodus sowie eine erhebliche Beeinträchtigung der Transkriptionsfähigkeit. Zudem konnte gezeigt werden, dass die bereits nachgewiesene Interaktion zwischen VP30 und VP35 RNA-abhängig ist. Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Arbeit eine starke Korrelation zwischen RNA-Bindung und Transkriptionsaktivierung gezeigt und damit erstmals die RNA-Bindungsfähigkeit von VP30 in einen physiologischen Kontext gestellt. Im Zuge einer Transkriptomanalyse mittels Next Generation Sequencing (NGS) konnten kurze Abbruchtranskripte im Bereich der mRNA-Starts der verschiedenen Gene detektiert werden, die genau mit den vorhergesagten Haarnadelstrukturen in diesen Regionen korrelierten. Zusätzlich konnte ein leader-Transkript und zwei Transkripte innerhalb der intergenischen Region zwischen VP30 und VP24 gefunden werden. Das leader-Transkript wurde anschließend experimentell durch Northern Blot bestätigt und sein Verhältnis zur mRNA (NP) durch RT-qPCR bestimmt (mRNA/leader-Transkript: ca. 8.7:1). Damit konnte erstmals die Existenz eines leader-Transkriptes für das Ebolavirus nachgewiesen werden, dessen potenzielle Funktion möglicherweise - analog zu leader-Transkripten anderer Viren - im Bereich der Regulation von Transkription vs. Replikation liegt.

Bibliographie / References

1. Leroy E.M., Gonzalez J.P., Baize S., Ebola and Marburg haemorrhagic fever viruses: major scientific advances, but relatively minor public health threat for Africa. Clin Microbiol Infect 2011; 17(7):964-76. [12] Shears P., O´Dempsey T.J., Ebola virus disease in Africa: epidemiology and nosocomial transmission. J Hosp Infect 2015 pii: S0195-6701(15)00046-8. [13] http://apps.who.int/ebola/ebola-situation-reports; aufgerufen am 01.10.15. [14]
2. Fabozzi G., Nabel C.S., Dolan M.A., Sullivan N.J., Ebolavirus proteins suppress the effects of small interfering RNA by direct interaction with the mammalian RNA interference pathway. J Virol 2011; 85(6);2512-23. [34] http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/130997/1/WHO_HIS_KER_GHE_14.1_eng.pdf; aufgerufen am 10.08.15 [35]
3. Noda T., Sagara H., Suzuki E., Takada A., Kida H., Kawaoka Y., Ebola virus VP40 drives the formation of virus-like filamentous particles along with GP. J Virol 2006; 76(10):4855-65. [56]
4. Weik M., Modrof J., Klenk H.D., Becker S., Mühlberger E., Ebola virus VP30-mediated transcription is regulated by RNA secondary structure formation. J Virol 2002; 76(17):8532-9. [95]
5. Cox N.J., McCormick J.B., Johnson K.M., Kiley M.P., Evidence for two subtypes of Ebola virus based on oligonucleotide mapping of RNA. J Infect Dis 1983; 147(2):272-5. [8]
6. Martinez M.J., Volchkova V.A., Raoul H., Alazard-Dany N., Reynard O., Volchkov V.E., Role of VP30 phosphorylation in the Ebola virus replication cycle. J Infect Dis 2011; 204(S3):934- 40. [88]
7. Marzi A., Robertson S.J., Haddock E., Feldmann F., Hanley P.W., Scott D.P., Strong J.E., Kobinger G., Best S.M., Feldmann H., EBOLA VACCINE. VSV-EBOV rapidly protects macaques against infection with the 2014/15 Ebola virus outbreak strain. Science 2015; 349(6249):739-42. [51]
8. Rampling T., Ewer K., Bowyer G., Wright D., Imoukhuede E.B., Payne R., Hartnell F., Gibani M., Bliss C., Minhinnick A., Wilkie M., Venkatraman N., Poulton I., Lella N., Roberts R., Sierra- Davidson K., Krähling V., Berrie E., Roman F., De Ryck I., Nicosia A., Sullivan N.J., Stanley D.A., Ledgerwood J.E., Schwartz R.M., Siani L., Colloca S., Folgori A., Di Marco S., Cortese R., Becker S., Graham B.S., Koup R.A., Levine M.M., Moorthy V., Pollard A.J., Draper S.J., Ballou W.R., Lawrie A., Gilbert S.C., Hill A.V., A Monovalent Chimpanzee Adenovirus Ebola Vaccine – Preliminary Report. N Engl J Med 2015; Epub ahead of print. [46] Henao-Restrepo A.M., Longini I.M., Egger M., Dean N.E., Edmunds W.J., Camacho A., Carroll M.W., Doumbia M., Draguez B., Duraffour S., Enwere G., Grais R., Gunther S., Hossmann S., Kondé M.K., Kone S., Kuisma E., Levine M.M., Mandal S., Norheim G., Riveros X., Soumah A., Trelle S., Vicari A.S., Watson C.H. Keita S., Kieny M.P., Rottingen J.A., Efficacy and effectiveness of an rVSV-vectored vaccine expressing Ebola surface glycoprotein: interim results from the Guinea ring vaccination cluster-randomised trial. Lancet 2015; 386(9996):857- 66.
9. Geisbert T.W., Hensley L.E., Gibb T.R., Steele K.E., Jaax N.K., Jahrling P.B., Apoptosis induced in vitro and in vivo during infection by Ebola and Marburg viruses. Lab Invest 2000; 80(2):171-186. [29] Reed D.S., Hensley L.E., Geisbert J.B., Jahrling P.B., Geisbert T.W., Depletion of peripheral blood T lymphocytes and NK cells during the course of ebola hemorrhagic Fever in cynomolgus macaques. Viral Immunol 2004; 17(3):390-400. [30]
10. Bradford M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72:248-54.
11. Empig C.J., Goldsmith M.A., Association of the caveola vesicular system with cellular entry by filoviruses. J Virol 2002; 76(10):5266-70. [73] Bhattacharyya S., Hope T.J., Young J.A., Differential requirements for clathrin endocytic pathway components in cellular entry by Ebola and Marburg glycoprotein pseudovirions. Virology 2011; 419(1):1-9. [74]
12. Saeed M.F., Kolokoltsov A.A., Albrecht T., Davey R.A., Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog 2010; 6(9):e1001110. [75] Nanbo A., Imai M., Watanabe S., Noda T., Takahashi K., Neumann G., Halfmann P., Kawaoka Y., Ebolavirus is internalized into host cells via macropinocytosis in a viral glycoprotein- dependent manner. PLoS Pathog 2010; 6(9):e1001121. [76]
13. Volchkov V.E., Volchkova V.A., Chepurnov A.A., Blinov V.M., Dolnik O., Netesov S.V., Feldmann H., Characterizatino of the L gene and 5´trailer5´trailer region of Ebola virus. J Gen Virol 1999; 80(Pt2):355-62. [62]
14. Mühlberger E., Weik M., Volchkov V.E., Klenk H.D., Becker S., Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artifical replication systems. J Virol 1999; 73(3):2333-42. [99]
15. Baize S., Leroy E.M., Georges-Courbot M.C., Capron M., Lansoud-Soukate J., Debré P., Fisher-Hoch S.P., McCormick J.B., Georges A.J., Defective humoral responses and extensive intravascular apoptosis are associated with fatal outcome in Ebola virus-infected patients. Nat Med 1999; 5(4):423-6. [31]
16. Elliott L.H., Kiley M.P., McCormick J.B., Descriptive analysis of Ebola virus proteins. Virology 1985; 147(1):169-76. [54]
17. Geisbert T.W., Jahrling P.B., Differentiation of filoviruses by electron microscopy. Virus Res 1995; 39(2-3):129-150. [52]
18. Vanderzanden L., Bray M., Fuller D., Roberts T., Custer D., Spik K., Jahrling P., Huggins J., Schmaljohn A., Schmaljohn C. DNA vaccines expressing either the GP or NP genes of Ebola virus protect mice from lethal challenge. Virology 1998; 246(1):134-44. [48]
19. Lott W.B., Doran M.R., Do RNA viruses require genome cyclisation for replication?. Trends Biochem Sci 2013; 38(7):350-5. [66] Takada A., Fujioka K., Tsuiji M., Morikawa A., Higashi N., Ebihara H., Kobasa D., Feldmann H., Irimura T., Kawaoka Y., Human macrophage C-type lectin specific for galactose and N- acetylgalactosamine promotes filovirus entry. J Virol 2004; 78(6):2943-7.
20. Zinzula L., Esposito F., Pala D., Tramontano E., dsRNA binding characterization of full length recombinant wild type and mutants Zaire ebolavirus VP35. Antiviral Res 2012; 93(3):354-63.
21. Feldmann H., Geisbert T.W., Ebola haemorrhagic fever. Lancet 2011; 377(9768):849-62. [18]
22. Calain P., Monroe M.C., Nichol S.T., Ebola virus defective interfering particles and persistent infection. Virology 1999; 262(1):114-28.
23. Aleksandrowicz P., Marzi A., Biedenkopf N., Beimforde N., Becker S., Hoenen T., Feldmann H., Schnittler H.J., Ebola virus enters host cells by macropinocytosis and clathrin-mediated endocyctosis. J Infect Dis 2011; 204(S3):957-67. [77]
24. Ruf W., Emerging roles of tissue factor in viral hemorrhagic fever. Trends Immunol. 2004; 25(9):461-4.
25. Chandran K., Sullivan N.J., Felbor U., Whelan S.P., Cunningham J.M., Endosomal proteolysis of the Ebola virus glycoprotein is necessary for infection. Science 2005; 308(5728):1643-5. [79]
26. Regules J.A., Beigel J.H., Paolino K.M., Voell J., Castellano A.R., Munoz P., Moon J.E., Ruck R.C., Bennett J.W., Twomey P.S., Gutierrez R.L., Remich S.A., Hack H.R., Wisniewski M.L., Joselyn M.D., Kwilas S.A., Van Deusen N., Mbaya O.T., Zhou Y., Stanley D.A., Bliss R.L., Cebrik D., Smith K.S., Shi M., Ledgerwood J.E., Graham B.S., Sullivan N.J., Jagodzinski L.L., Peel S.A., Alimonti J.B., Hooper J.W., Silvera P.M., Martin B.K., Monath T.P., Ramsey W.J., Link C.J., Lane H.C., Michael N.L., Davey R.T. Jr., Thomas S.J.; rVSVΔG-ZEBOV-GP Study Group., A Recombinant Vesicular Stomatits Virus Ebola Vaccine – Preliminary Report. N Engl J Med 2015; Epub ahead of print. [43]
27. Geisbert T.W., Pushko P., Anderson K., Smith J., Davis K.J., Jahrling P.B., Evaluation in nonhuman primates of vaccines against Ebola virus. Emerg Infect Dis 2002; 8(5):503-7. [41]
28. Leroy E.M., Kumulungui B., Pourrut X., Rouquet P., Hassanin A., Yaba P., Délicat A., Paweska J.T., Gonzalez J.P. Swanepoel R., Fruit bats as reservoirs of Ebola virus. Nature 2005; 438(7068):575-6. [15]
29. Feldmann H., Will C., Schikore M, Slenczka W., Klenk H.D., Glycosylation and oligomerization of the spike protein of Marburg virus. Virology 1991; 182(1):353-6. [58]
30. Volchkov V.E., Becker S., Volchkova V.A., Ternovoj V.A., Kotov A.N., Netesov S.V., Klenk H.D., GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7 and vaccinia virus polymerase. Virology 1995; 214(2):421-30. [59] Sanchez A., Trappier S.G., Mahy B.W., Peters C.J., Nichol S.T., The virion glycoproteins of Ebola viruses are encoded in two reading frames and are expressed through transcriptional editing. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93(8):3602-7. [60]
31. Leroy E.M., Epelboin A., Mondonge V., Pourrut X., Gonzalez J.P., Muyembe-Tamfum J.J., Formenty P., Human Ebola outbreak resulting from direct exposure to friut bats in Luebo, Democratic Republic of Congo, 2007. Vector Borne Zoonotic Dis 2009; 9(6):723-8.
32. Baize S., Leroy E.M., Georges A.J., Georges-Courbot M.C., Capron M., Bedjabaga I., Lansoud-Soukate J., Mayoungou E., Inflammatory responses in Ebola virus-infected patients. Clin Exp Immunol 2002; 128(1):163-8. [24]
33. Mason S.W., Aberg E., Lawetz C., DeLong R., Whitehead P., Liuzzi M., Interaction between human respiratory syncytial virus (RSV) M2-1 and P proteins is required for reconstitution of M2-1-dependent RSV minigenome acitvity. J Virol 2003; 77(19):10670-6.
34. Blumberg B.M., Leppert M., Kolakofksy D., Interaction of VSV Leader RNA and Nucleocapsid Protein May Control VSV Genome Replication. Cell 1981; 23(3):837-45.
35. Le Guenno B., Formenty P. Wyers M., Gounon P., Walker F., Boesch C., Isolation and partial characterisation of a new strain of Ebola virus. Lancet 1995; 345(8960):1271-74. [9]
36. Villinger F., Rollin P.E., Brar S.S., Chikkala N.F., Winter J., Sundstorm J.B., Zaki S.R., Swanepoel R., Ansari A.A., Peters C.J., Markedly elevated levels of interferon (IFN)-gamma, IFN-alpha, interleukin (IL)-2, IL-10, and tumor necrosis factor-alpha associated with fatal Ebola virus infection. J Infect Dis 1999; 179 Suppl 1:S188-191. [26]
37. Modrow S., Falke D, Truyen U., Schätzl H., Molekulare Virologie; Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 3. Auflage 2010. [3] Negredo A., Palacios G., Vázquez-Morón S., González F., Dopazo H., Molero F., Juste J., Quetglas J., Savji N., de la Cruz Martínez M., Herrera J.E., Pizzaro M., Hutchison S.K., Echevarría J. E., Lipkin W.I., Tenorio A., Discovery of an ebolavirus-like filovirus in europe. PLoS Pathog 2011; 7(10):e1002304. [4]
38. Gupta M., Mahanty S., Ahmed R., Rollin P.E., Monocyte-derived human macrophages and peripheral blood mononuclear cells infected with ebola virus secrete MIP-1alpha and TNF- alpha and inhibit poly-IC-induced IFN-alpha in vitro. Virology 2001; 284(1):20-5. [23]
39. Halpin K., Bankamp B., Harcourt B.H., Bellini W.J., Rota P.A., Nipah virus conforms to the rule of six in a minigenome replication assay. J Gen Virol 2004; 85(Pt3):701-7. [65]
40. Hartlieb B., Modrof J., Mühlberger E., Klenk H.D., Becker S., Oligomerization of Ebola virus VP30 is essential for viral transcription and can be inhibited by a synthetic peptide. J Biol Chem 2003; 278(43):41830-6. [92] Ilinykh P.A., Tigabu B., Ivanov A., Ammosova T., Obukhov Y., Garron T., Kumari N., Kovalskyy D., Platonov M.O., Naumchik V.S., Freiberg A.N., Nekhai S., Bukreyev A., Role of protein phosphatase 1 in dephosphorylation of Ebola virus VP30 protein and its targeting for the inhibition of viral transcription. J Biol Chem 2014; 289(33):22723-38. [93]
41. Siegert R., Shu H.L., Slenczka W., Peters D., Müller G., On the etiology of an unknown human infection originating from monkeys. Dtsch Med Wochenschr 1967; 92(51):2341-3. German. [5] WHO. Ebola haemorrhagic fever in Sudan, 1976. Bull World Health Organ 1978; 56(2):247- 70. [6] WHO. Ebola haemorrhagic fever in Zaire, 1976. Bull World Health Organ 1978; 56(2): 271-93. [7]
42. Geisbert T.W., Hensely L.E., Larsen T., Young H.A., Reed D.S., Geisbert J.B., Scott D.P., Kagan E., Jahrling P.B., Davis K.J., Pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever in cynomolgus macaques: evidence that dendritic cells are early and sustained targets of infection. Am J Pathol 2003; 163(6):2347-70. [19] Ryabchikova E.I., Kolesnikova L.V., Luchko S.V., An analysis of features of pathogenesis in two animal model of Ebola virus infection. J Infect Dis 1999; 179 Suppl 1:S199-202. [20]
43. Biedenkopf N., Hartlieb B., Hoenen T., Becker S., Phosphorylation fo the Ebola virus VP30 influences the composition of the viral nucleocapsid complex: impact on viral transcription and replication. J Biol Chem 2013; 288(16):11165-74. [89]
44. Modrof J., Mühlberger E., Klenk H.D., Becker S, Phosphorylation of VP30 impairs ebola virus transcription. J Biol Chem 2002; 277(36):33099-104. [87]
45. Jahrling P.B.. Geisbert T.W., Dalgard D.W., Johnson E.D., Ksiazek T.G., Hall W.C., Peters C.J., Preliminary report: isolation of Ebola virus from monkeys imported to USA. Lancet 1990; 335(8688):502-05. [11]
46. Choi W.Y, Hong K.J., Hong J.E., Lee W.J., Progress of vaccine and drug development for Ebola preparedness. Clin Exp Vaccine Res 2015; 4(1):11-6. [49]
47. Grosfeld H., Hill M.G., Collins P.L., RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. J Virol 1995; 69(9):5677-86.
48. Martínez M.J., Biedenkopf N., Volchkova V., Hartlieb B., Alazard-Dany N., Reynard O., Becker S., Volchkov V., Role of Ebola virus VP30 in transcription reinitiation. J Virol 2008; 82(24):12569-73. [96] Conzelmann K.K., Nonsegmented negative-strand RNA viruses: genetics and manipulation of viral genomes. Annu Rev Genet 1998; 32:123-62. [97]
49. Coté M., Misasi J., Ren T., Bruchez A., Lee K., Filone C.M., Hensley L., Li Q. Ory D., Chandran K., Cunningham J., Small molecule inhibitors reveal Niemann-Pick C1 is essential for Ebola virus infection. Nature 2011; 477(7364):344-8. [81]
50. Köhler K., Duchardt-Ferner E., Lechner M., Damm K., Hoch P.G., Salas M., Hartmann R.K., Structural and mechanistic characterization of 6S RNA from the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Biochimie 2015.
51. Blondot M.L., Dubosclard V., Fix J., Lassoued S., Aumont-Nicaise M., Bontems F., Eléouet J.F., Sizun C., Structure and functional analysis of the RNA-and viral phosphoprotein-binding domain of the respiratory syncytial virus M2-1 protein. PLoS Pathog 2012; 8(5):e1002734.
52. Liang B., Li Z., Jenni S., Rahmeh A.A., Morin B.M., Grant T., Grigorieff N., Harrison S.C., Whelan S.P., Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell 2015; 162(2):314.27. [84] Shabman R.S., Jabado O.J., Mire C.E., Stockwell T.B., Edwards M., Mahajan M., Geisbert T.W., Basler C.F., Deep sequencing identifies noncanonical editing of Ebola and Marburg virus RNAs in infected cells. MBio 2014; 5(6):e02011.
53. Bertani G., Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. J Bacteriol 1951; 62(3):293-300.
54. Mühlberger E., Trommer S., Funke C., Volchkov V., Klenk H.D., Becker S, Termini of all mRNA species of Marburg virus: sequence and secondary structure. Virology 1996; 223(2):376-80. [86]
55. Huang Y., Xu L., Sun Y., Nabel G.J., The assembly of Ebola virus nucleocapsid requires virion-associated proteins 35 and 24 and posttranslational modification of nucleoprotein. Mol Cell 2002; 10(2):307-16. [55]
56. Hardy R.W., Wertz G.W., The Cys(3)-His(1) motif of the respiratory syncytial virus M2-1 protein is essential for protein function. J Virol 2000; 74(13):5880-5.
57. Hunt C.L., Kolokoltsov A.A., Davey R.A., Maury W., The Tyro3 receptor kinase AxI enhances macropinocytosis of Zaire ebolavirus. J Virol 2011; 85(1):334-47. [78]
58. Ferron F., Decroly E., Seliska B., Canard B., The viral RNA capping machinery as target for antiviral drugs. Antiviral Res 2012; 96(1):21-31. [83]
59. Geisbert T.W., Jahrling P.B., Towards a vaccine against Ebola virus. Expert Rev Vaccines 2003; 2(6):777-89. [42]
60. Dowell S.F., Mukunu R., Ksiazek T.G., Khan A.S., Rollin P.E., Peters C.J., Transmission of Ebola hemorrhagic fever: a study of risk factors in family members, Kikwit, Democrativ Republic of the Congo, 1995. Commission de Lutte contre les Epidémies à Kikwit. J Infect Dis 1999; 179 Suppl 1: S87-91. [16]
61. Baskerville A., Fisher-Hoch S.P., Neild G.H., Dowsett A.B., Ultrastructural pathology of experimental Ebola haemorrhagic fever virus infection. J Pathol 1995; 147(3):199-209. [21]
62. Marzi A., Feldmann H., Geisbert T.W., Falzarano D., Vesicular Stomatitis Virus-Based Vaccines for Prophylaxos and Treatment of Filovirus Infections. J Bioterror Biodef 2011; S1(4). [50]
63. Tanner S.J., Ariza A., Richard C.A., Kyle H.F., Dods R.L., Blondot M.L., Wu W., Trincao J., Trinh C.H., Hiscox J.A., Carroll M.W., Silman N.J., Eléouet J.F., Edwards T.A., Barr J.N., Crystal structure of the essential transcription antiterminator M2-1 protein of human respiratory syncytial virus and implications of its phosphorylation. Proc Natl Acad Sci U S A 2014; 111(4):1580-5.
64. Leyrat C., Renner M., Harlos K., Huikonen J.T., Grimes J.M., Drastic changes in conformational dynamics of the antiterminator M2-1 regulate transcription efficiency in Pneumovirinae. Elife 2014; 3:e02674.
65. Cuesta I, Geng X., Asenja A., Villanueva N., Structural phosphoprotein M2-1 of the human respiratory syncytial virus is an RNA binding protein. J Virol 2000; 74(21):9858-67.
66. Fearns R., Collins P.L., Role of the M2-1 transcription antitermination protein of respiratory syncytial virus in sequential transcription. J Virol 1999; 73(7):5852-64. [98]
67. Ströher U., West E., Bugany H., Klenk H.D., Schnittler H.J., Feldmann H., Infection and activation of monocytes by Marburg and Ebola viruses. J Virol 2001; 75(22):11025-33. [22]
68. Weik M., Enterlein S., Schlenz K., Mühlberger E., The Ebola virus genomic replication promoter is bipartite and follows the rule of six. J Virol 2005; 79(16):10660-71. [63]
69. Han Z., Boshra H., Sunyer J.O., Zwiers S.H., Paragas J., Harty R.N., Biochemical and functional characterization of the Ebola virus VP24 protein: implications for a role in virus assembly and budding. J Virol 2003; 77(3):1793-800. [57]
70. Schornberg K., Matsuyama S., Kabsch K., Delos S., Bouton A., White J., Role of endosomal cathepsins in entry mediated by the Ebola virus glycoprotein. J Virol 2006; 80(8):4174-8. [80]
71. Modrof J., Becker S., Mühlberger E., Ebola virus transcription activator VP30 is a zinc-binding protein. J Virol 2003; 77(5):3334-8. [90]
72. Feldmann H., Bugany H., Mahner F., Klenk H.D., Drenckhahn D., Schnittler H.J., Filovirus- induced endothelial leakage triggered by infected monocytes/macrophages. J Virol 1996; 70(4):2208-14. [27]
73. John S.P., Wang T., Steffen S., Longhi S., Schmaljohn C.S., Jonsson C.B., Ebola virus VP30 is an RNA binding protein. J Virol 2007; 81(17):8967-76. [91]
74. Hartlieb B., Muziol T., Weissenhorn W., Becker S., Crystal structure of the C-terminal domain of Ebola virus VP30 reveals a role in transcription and nucleocapsid association. Proc Natl Acad Sci U S A 2007; 104(2):624-9.
75. Calain P., Roux L., The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J Virol 1993; 67(8):4822-30. [64]
76. Towner J.S., Sealy T.K., Khristova M.L., Albarino C.G., Conlan S., Reeder S.A., Quan P.L., Lipkin W.I., Downing R., Tappero J.W., Okware S., Lutwama J., Bakamutumaho B., Newly discovered ebola virus associated with hemorrhagic fever outbreak in Uganda. Plos Pathog 2008; 4(11):e1000212. [10]
77. Tran T.L., Castagné N., Dubosclard V., Noinville S., Koch E., Moudjou M., Henry C., Bernard J., Yeo R.P., Eléouet J.F., The respiratory syncytial virus M2-1 protein forms tetramers and interacts with RNA and P in a competitive manner. J Virol 2009; 83(13): 6363-74.
78. Hoffmann S., Otto C., Kurtz S., Sharma C.M., Khaitovich P. Vogel J., Stadler P.F., Hackermueller J., Fast mapping of short sequences with mismatches, insertions and deletions using index structures. PLoS Comput Biol 2009; 5(9):e1000502.
79. Nicol J.W., Helt G.A., Blanchard S.G. Jr., Raja A., Loraine A.E., The Integrated Genome Browser: free software for distribution and exploration of genome-scale datasets. Bioinformatics 2009; 25(20):2730-1.
80. Wauquier N., Becquart P., Padilla C., Baize S., Leroy E.M., Human fatal zaire ebola virus infection is associated with an aberrant innate immunity and with massive lymphocyte apoptosis. Plos Negl Trop Dis 2010; 4(10) pii: e837. [25]
81. Mehedi M., Falzarano D., Seebach J., Hu X., Carpenter M.S., Schnittler H.J., Feldmann H., A new Ebola virus nonstructural glycoprotein expressed through RNA editing. J Virol 2001; 85(11):54076-14. [61]
82. Roelofs K.G., Wang J., Sintim H.O., Lee V.T., Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc Natl Acad Sci U S A 2011; 108(37):15528-33.
83. Bharat T.A., Noda T., Riches J.D., Kraehling V., Kolesnikova L., Becker S., Kawaoka Y., Briggs J.A., Structural dissection of Ebola virus and its assembly determinants using cryo- electron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109(11):4275-80. [53]
84. Carette J.E., Raaben M., Wong A.C., Herbert A.S., Obernosterer G., Mulherkar N., Kuehne A.I., Kranzusch P.J., Griffin A.M., Ruthel G., Dal Cin P., Dye J.M., Whelan S.P., Chandran K., Brummelkamp T.R., Ebola virus entry requires the cholesterol transporter Niemann-Pick C1. Nature 2011; 477(7364):340-3. [82]
85. Reid S.P., Cárdenas W.B., Basler C.F., Homo-oligomerization facilitates the interferon- antagonist activity of the ebolavirus VP35 protein. Virology 2005; 341(2):179-89.
86. Donaldson G.P., Roelofs K.G., Luo Y., Sintim H.O., Lee V.T., A rapid assay for affinity and kinetics of molecular interactions with nucleic acids. Nucleic Acids Res 2012; 40(7):e48. [112] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/. [113] http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. [114] http://rna.tbi.univie.ac.at/. [115] http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi. [116] http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold. [117] http://eu.idtdna.com/calc/analyzer. [118] http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/. [119] http://www.expasy.org/.
87. Qiu X., Wong G., Audet J., Bello A., Fernando L., Alimonti J.B., Fausther-Bovendo H., Wei H., Aviles J., Hiatt E., Johnson A., Morton J., Swope K., Bohorov O., Bohorova N., Goodman C., Kim D., Pauly M.H., Velasco J., Pettitt J., Olinger G.G., Whaley K., Xu B., Strong J.E., Zeitlin L., Kobinger G.P., Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp. Nature 2014; 514(7520):47-53. [36] https://clinicaltrials.gov (Identifier: NCT02363322 und NCT02389192; aufgerufen am 09.09.15) [37] https://clinicaltrials.gov (Identifier: NCT0204175 und NCT01518881; aufgerufen am 09.09.15) [38] http://www.vfa.de/de/arzneimittel-forschung/woran-wir-forschen/ebola-medikamente (aufgerufen am 09.09.2015).

Das Dokument ist im Internet frei zugänglich - Hinweise zu den Nutzungsrechten