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Titel:Die zeitliche Stabilität und zelluläre Lokalisation von Arrestin-Rezeptorkomplexen wird durch die Rezeptorphosphorylierung determiniert.
Autor:Zindel, Diana
Weitere Beteiligte: Brünemann, Moritz (Prof. Dr.)
Veröffentlicht:2015
URI:https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2015/0369
URN: urn:nbn:de:hebis:04-z2015-03697
DOI: https://doi.org/10.17192/z2015.0369
DDC: Naturwissenschaften
Titel(trans.):Receptor phosphorylation determines temporal stability and cellular localization of arrestin-receptor-complexes
Publikationsdatum:2016-02-04
Lizenz:https://rightsstatements.org/vocab/InC-NC/1.0/

Dokument

Schlagwörter:
FRAP, Arrestine, phosphorylation, Tandem-Massenspektrometrie, FRET, G-Protein gekoppelte Rezeptoren, Phosphorylierung, PTH1R, GPCRs, FRAP, arrestins, LC-MS/MS, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Zusammenfassung:
Die Phosphorylierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren spielt eine bedeutende Rolle für die Interaktion mit Arrestinen und die Rezeptordesensibilisierung. Es ist jedoch unklar, wie unterschiedliche Phosphorylierungsmuster die Interaktion von Arrestin mit Rezeptoren und den nachfolgende Transportmuster von Arrestin Rezeptorkomplexen beeinflussen. In dieser Arbeit wurden zusätzliche Phosphorylierungsstellen in den C-Terminus des β2-adrenergen Rezeptors eingefügt. Es konnte gezeigt werden, dass die Rezeptormutante β2AR SSS verstärkt phosphoryliert wurde und eine Erhöhung der Affinität zu Arrestin 3 aufwies. Darüber hinaus war das Transportmuster von Arrestin-3 mit diesem Rezeptor verändert. Die Rekrutierung von Arrestin-3 und die Stabilität von Arrestin-3-Rezeptorkomplexen wurden in Echtzeit mittels FRET und FRAP bestimmt. Es wurde gezeigt, dass Arrestin-3 schnell und fast vollständig vom β2AR dissoziiert, während die Interaktion mit dem β2AR SSS 2-4 fach verlängert war. Die Arrestin-Interaktion mit einer β2V2-Rezeptorchimäre war innerhalb des betrachteten Zeitfensters kaum reversibel. Weitere Untersuchungen der Arrestin 3 Lokalisation ergaben, dass zusätzliche Phosphorylierungsstellen im β2AR SSS zur Kolokalisation von Arrestin-Rezeptorkomplexen auf Endosomen führte. Der Wildtyp-Rezeptor hingegen interagiert nur transient mit Arrestin an der Plasmamebran. Der β2AR SSS internalisierte stärker als der β2AR, das Recycling für beide Rezeptoren verlief jedoch sehr ähnlich. Somit konnte diese Arbeit zeigen, dass die Interaktion zwischen Arrestin und Rezeptoren durch minimale Rezeptormodifikationen verstärkt werden kann und dass diese Veränderung ausreicht, um das Transportverhalten von Arrestin zu verändern. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnten durch MS/MS Experimente ligandenabhängige Phosphorylierungsstellen im C-Terminus des humanen PTHR bestimmt werden. Dabei wurden drei bisher nicht identifizierte Stellen detektiert: T503, S519 und T547. Die Quantifizierung der agonistabhängigen PTHR-Phosphorylierung ergab, dass vor allem der Bereich zwischen S489 und S495 stark phosphoryliert wird oder für die Phosphorylierung nachfolgender Serin und Threoninreste erforderlich ist. Bei der funktionellen Charakterisierung der Phosphorylierungsstellen stellte sich hingegen heraus, dass insbesondere die Phosphorylierung zwischen S501-T506, im proximalen PTHR-C-Terminus für die Interaktion mit Arrestin-3 relevant ist. Dieser Bereich spielt für das Ausmaß der Gesamtphosphorylierung des Rezeptors nur eine untergeordnete Rolle. Innerhalb dieses Clusters nehmen T503 und S504 eine wichtige Rolle für die robuste Interaktion mit Arrestin 3 ein. Obwohl die Mutation der Phosphorylierungsstellen im proximalen PTHR-C-Terminus zu Alanin die Interaktion mit Arrestin massiv beeinträchtigte, konnte mit keinem der in dieser Arbeit getesteten Rezeptorkonstrukte eine vollständige Inhibierung der Arrestin-3-Interaktion mit dem PTHR erzielt werden. Dass die Stabilität von Arrestin-Rezeptorkomplexen nicht nur durch Modifikationen auf Rezeptorebene, sondern auch durch Modifikationen in Arrestin beeinflusst werden kann, wurde im dritten Teil dieser Arbeit gezeigt. Selbst konservierende Mutationen in phophatsensitiven Elementen im N-Terminus von Arrestin-3 führten zur Reduktion der Affinität zum β2AR, dem β2AR SSS, dem β2V2R und dem PTHR. Dadurch wurde auch die Kompartimentalisierung dieser Rezeptoren mit Arrestin beeinträchtigt. Die Kolokalisation von Arrestin 3K11,12R mit dem β2V2R und dem β2AR SSS auf Endosomen war zwar verringert, jedoch nicht ganz aufgehoben. Mit dem PTHR hingegen war kein endosomaler Kotransport mit Arrestin 3K11,12R zu beobachten. Daraus geht hervor, dass die Rolle der beiden Lysine für die Kompartimentalisierung von Arrestin-Rezeptorkomplexen nicht für alle Rezeptoren einheitlich ist. Zusammenfassend zeigen die Resultate dieser Arbeit, dass Arrestin unterschiedliche Phosphorylierungszustände im proximalen C-Terminus G-Protein-gekoppelter Rezeptoren erkennen kann. Die zeitliche Stabilität von Arrestin-Rezeptorkomplexen wird durch die Anzahl und die Lokalisation von Phosphorylierungsstellen im C-Terminus von Rezeptoren bestimmt. Dies wirkt sich auch auf die zelluläre Lokalisation von Arrestin-Rezeptorkomplexen aus: Je höher die zeitliche Stabilität eines Arrestin-Rezeptor-Komplexes ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass diese in intrazellulären Kompartimenten, wie Endosomen zu finden sind. Diese Befunde unterstützen die Hypothese, dass Arrestin rezeptorspezifische und phosphorylierungsspezifische Komplexe bilden kann.

Summary:
Agonist-induced phosphorylation of GPCRs is a significant prerequisite for the interaction with arrestins and receptor desensitization. Yet, it is unclear how different phosphorylation patterns impact on the interaction of arrestins with receptors and determine subsequent trafficking patterns of arrestin receptor complexes. In the present thesis this question was investigated at the β2-adrenoceptor and the parathyroid hormone receptor. First, an additional serine cluster was inserted into the proximal part of the β2-adrenoceptor´s C terminus. This receptor mutant, termed β2AR SSS, showed enhanced agonist dependent phosphorylation and an increase in the affinity for arrestin 3. In addition, the intracellular trafficking of arrestin 3 with this receptor was altered. The arrestin recruitment and the stability of arrestin receptor complexes were determined in real time by FRET and FRAP. It could be demonstrated that arrestin 3 dissociated quickly from the β2AR whereas the interaction with the β2AR SSS was two-to fourfold prolonged. The interaction of arrestin with a β2V2 chimera was poorly reversible during the timescale of the experiment. Further experiments revealed that the additional phosphorylation sites in the β2AR SSS led to colocalization of arrestin receptor complexes on early endosomes in response to agonist. In contrast, the wild type receptor interacted only transiently with arrestin at the plasma membrane. Furthermore the β2AR SSS internalized more efficiently than the β2AR whereas the recycling kinetics were very similar for both receptors. It was thus possible to show that the affinity between arrestins and receptors could be increased with minimal receptor modification. This was sufficient to alter the trafficking pattern of arrestin. In the second part of this thesis the ligand-dependent phosphorylation sites of the human PTHR were determined by LC-MS/MS. Ten phosphorylation sites could be identified of which three had not been described so far: T503, S519 and T547. The quantification of the ligand-dependent phosphorylation in PTHR mutants revealed that the first large serine cluster between S489-S495 in the C-terminal tail of the PTHR was massively phosphorylated or important for the phosphorylation of subsequent serine and threonine residues. Mutation of Ser and Thr residues between S501 and T506 showed that these residues play a crucial role for the interaction with arrestin 3. However, the extent of ligand dependent phosphorylation within this second cluster was smaller than the phosphorylation within the first cluster. T503 und S504 within the second cluster were essential for the robust interaction with arrestin-3. Although the mutation of phosphorylation sites in the proximal part of the C-terminus of the PTHR to alanine massively reduced the interaction with arrestin 3, in none of the receptor mutants was the interaction with arrestin abolished entirely The stability of arrestin-receptor-complexes can not only be influenced on the level of receptors but can also be modified by modifications in arrestin. Two lysine to arginine mutations within phosphate-sensing elements in the N-terminus of arrestin 3 (K11,12R) were able to reduce the arrestin 3 affinity towards the β2AR, the β2AR SSS and the PTHR. Notably this impacted on the compartmentalization of these receptors with arrestin. Whereas the colocalization of Arrestin K11,12R on endosomes with the β2AR SSS or the β2V2R was reduced, no cotrafficking of ArrestinK11,12R could be observed with the PTHR. This suggests that, depending on the receptor subtype, phosphate-sensing elements within arrestin may be of varying significance. In summary the experiments in this thesis show that arrestin is able to sense differential phosphorylation patterns in the proximal part of the C-terminus of GPCRs. The temporal stability of arrestin-receptor complexes is determined by the number and the localization of phosphorylation sites in the C-terminus of the GPCRs that were examined in this thesis. Importantly, this impacts on the cellular localization of arrestin-receptor complexes. The higher the temporal stability of an arrestin receptor complex, the greater the probability will be that it can be found in endocytic compartments. These findings collectively suggest that arrestin is able to form receptor specific and phosphorylation specific complexes.


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