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Zusammenfassung:
Der Tumorsuppressor p53 wird als „Wächter des Genoms“ bezeichnet und spielt eine wichtige Rolle bei der Prävention von Krebserkrankungen. p53 ist ein sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor, der durch verschiedene Formen von Zellstress wie DNA-Schäden oder Onkogene aktiviert wird und in Abhängigkeit der Schwere der entstandenen Schäden eine Vielzahl verschiedener Zielgene transaktiviert, die Zellzyklus Arrest, Seneszenz, Differenzierung und Apoptose induzieren. Bei der Entscheidung über Überleben oder Sterben tragen posttranskriptionelle Modifikationen von p53 und Interaktionen mit Kofaktoren dazu bei, dass p53 bestimmte Gruppen von Zielgenen aktiviert. Es ist aber unklar, wie diese Entscheidung über das Zellschicksal auf der Ebene der Promotorbindung von Zielgenen durch p53 getroffen wird. Für die Bindung an die DNA bilden vier p53-Proteine ein Tetramer, wobei die DNA Bindungsdomänen kooperativ an die DNA binden. Dabei interagieren die H1-Helices der DNA-Bindungsdomänen zweier benachbarter p53-Monomere über eine Salzbrücke. Um den Einfluss der DNA-Bindungskooperativität für die tumorsuppressive Funktion von p53 zu untersuchen, wurden p53 H1-Helixmutanten generiert, die das komplette Spektrum von niedriger bis starker DNA-Bindungskooperativität aufweisen und bezüglich ihrer genomischen Bindung und Transaktivierung von Zielgenen sowie ihrer Antwort auf Stress untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Kooperativität eine Bindung an degenerierte Motive, wie sie in proapoptotischen Genen vorkommen, ermöglicht und so das Bindungsspektrum von p53 erweitert. Eine niedrige Kooperativität erlaubt die Induktion von Zellzyklus-Arrest, verhindert aber die Induktion von Apoptose. Somit moduliert die DNA-Bindungskooperativität die Entscheidung über das Zellschicksal, bestimmt die Eliminierung von geschädigten Zellen durch Apoptose und trägt zur Tumorsuppressoraktivität von p53 bei. Tumore sind heterogene Zellpopulationen, die aus genetisch unterschiedlichen Subklonen bestehen, die in einem iterativen Evolutionsprozess aus genetischer Mutation und Selektion entstehen. Die Mehrzahl der Tumorsubklone kann häufig therapeutisch zerstört werden, doch kann bei einer Therapie der starke Selektionsdruck das Auswachsen und Überleben resistenter Klone fördern. Das Verständnis über die genetischen Veränderungen in der klonalen Tumorentwicklung, die zur Tumorinitiation, Progression, Metastasierung, Therapieresistenz und Rezidiven beitragen, ist von großem Interesse, um Präventionsstrategien und Therapien zu entwickeln. Die Rolle einzelner Gene bei der Tumorentstehung kann spezifisch mittels RNA Interferenz unter Verwendung von short hairpin RNAs (shRNA) untersucht werden, die einen stabilen Funktionsverlust-Phänotyp generieren. Dabei werden in Experimenten shRNA-exprimierende Tumorzellen oft mit Fluoreszenzreportern markiert und verfolgt. Dies funktioniert gut in Zellkulturexperimenten oder Leukämie-Mausmodellen, aber nicht in soliden Tumoren, die 90% aller Tumore im Menschen ausmachen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Systems zur konstitutiven und induzierbaren Markierung von Tumorzellen mit sezernierten Luciferasen. Dafür wurde ein dualer Luciferase Assay entwickelt, der es ermöglicht, zwei unterschiedliche shRNA-exprimierende Tumorzellklone kompetitiv zu verfolgen, sowohl in vitro als auch in vivo. Die Aktivität der sezernierten Gaussia (GLuc) und Cypridina (CLuc) Luciferasen kann verlässlich und spezifisch in Überständen von Zellmischungen oder im Xenograft-Modell ohne größere Eingriffe durch minimalinvasive Methoden im Mausblut gemessen werden und korreliert mit der Tumorzellzahl, bzw. der Tumorgröße. Die Ergebnisse zeigen, dass sich mit diesem dualen Assay die Entwicklungsdynamik von Tumorsubklonen auch in soliden Tumoren zeitlich erfassen lässt, und etablieren die Anwendungsmöglichkeit zur Untersuchung einzelner Gene und deren Beitrag zur Tumorentwicklung, Metastasierung und Tumortherapie. Durch die Verwendung einer der Luciferasen als interne Kontrolle in diesem kompetitiven Ansatz zur Normalisierung der Daten ist die Varianz der Ergebnisse deutlich geringer und die Versuchstierzahlen können somit um bis zu drei Viertel reduziert werden. Durch Verwendung sezernierter Luciferasen konnte so unter Berücksichtigung des 3R-Prinzips eine Methodik etabliert werden, um die Anzahl und die Belastung von Tieren in der Tumorforschung deutlich zu reduzieren.

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9. Author contributions T.S. conceived the dual-secreted luciferase assay for monitoring clonal tumour evolution.
10. Bioluminescence imaging. Mice were anesthetized with Forane (Baxter).
11. Coelenterazine (50 mg) dissolved in 100 ml PBS was injected i.v. and mice were imaged immediately for 5 min using the IVIS 50 imaging platform (Caliper).
12. Statistical analysis. All data are presented as mean ± s.d. unless indicated otherwise. Correlation is indicated by the Pearson's correlation coefficient r. Statistical significance of single-time-point experiments was tested using nonparametric tests (Kolmogorov–Smirnov test for two group comparisons; Kruskal–Wallis test and Dunn's post test for multiple comparisons). Tumour growth curves were analysed by two-way analysis of variance. All statistics were calculated by GraphPad Prism. Po0.05 was considered statistically significant. References 1. Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature 255, 197–200 (1975).
13. Afterwards, mice were i.v. injected with 100 ml of a 1:500 dilution of vargulin (Targeting Systems) and imaged likewise. For ex vivo imaging, lungs were excised, placed in 24-well plates, bathed in 1 ml of coelenterazine reagent (stock diluted 1:1,000 in PBS) and imaged immediately for 1 s. After GLuc imaging, tumours were washed for 1 h in fresh PBS on ice to remove residual coelenterazine. CLuc was detected by adding 1 ml of vargulin solution (stock diluted 1:1,000 in Biolux Cypridina Luciferase Assay Buffer (NEB) prediluted 1:5 in PBS) and imaging for 1 s.
14. Mdm2 antibody by Christine Blattner (Karlsruhe Institute of Technology). Rag2 À / À ; IL2Rg À / À mice were provided by Cornelia Brendel (Philipps-University Marburg). We acknowledge support from DFG (TRR17, TRR81, KFO210), European Research Council, Deutsche Krebshilfe, Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung, Behring7Röntgen7 Stiftung, and the Universities of Giessen and Marburg Lung Center (LOEWE).
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17. Immunohistochemistry. Formalin-fixed tumour tissue was embedded in paraffin, cut and fixed on glass slides overnight at 37 °C. Upon antigen retrieval with Tris-EDTA pH 9.0, sections for double staining were blocked in Dual Endogenous Enzyme Blocking Reagent (Dako) and incubated with a-p53 antibody (DO-1, 1:1,000) in Antibody Diluent (Dako REAL) overnight at 4 °C. Biotinylated rabbit- anti-mouse antibody (Dako, E0464, 1:500) served as secondary antibody and was incubated with Streptavidin-labelled Peroxidase (KPL) followed by detection with DAB Plus Reagent Set (Life Technologies). For subsequent GLuc staining, sections were incubated with a-GLuc antibody (Nanolight Technologies 401 P, 1:1,000) at 4 °C overnight. Biotinylated goat-anti-rabbit antibody (Dako, E0432, 1:500) was used as secondary antibody and was detected with Phosphatase-labelled Strepta- vidin (KPL) and Liquid Permanent Red (Dako). Nuclei were counterstained with Mayersches Haemalaun (Merck) for 15 s before fixation in Mowiol.
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